貉是一种珍贵经济动物，是我国毛皮动物中最易养殖的品种，而提升毛皮品质是提高貉经济效益的重要措施。机体毛色随着毛黑色素含量的变化而变化，而酪氨酸酶是影响黑色素生成的重要限速酶[1]。酪氨酸酶有两个含铜离子位点构成的活性中心[2-3]，黑色素的生物合成是一个由酪氨酸酶活性中心催化体内酪氨酸羟化而启动一系列生化反应生成黑色素的过程[4]。国内学者对卡拉库尔羊的毛色研究发现，铜元素含量在毛中呈现黑色毛＞杂色毛＞白色毛的规律[5]。许兰娇等[6]在对乌骨鸡的研究中发现，添加适量的铜会影响器官、组织的黑色素含量以及酪氨酸酶活性。由此得知，饲粮中改变铜的含量会影响机体毛色的改变。此外，饲粮铜添加水平会明显改变血清中一些抗氧化酶的活性，国内学者研究发现，饲喂不同铜水平的饲粮，会影响猪、兔、羊、牛等动物血清中铜蓝蛋白和铜锌超氧化物歧化酶的活性，提高清除体内自由基能力，从而提高机体免疫力[7-10]。我国是世界毛皮生产大国，但由于高档毛皮产量较低，因此也是毛皮进口大国，为提高貉的毛皮品质，减少貉在饲养中的疾病问题，本试验通过在饲粮中添加不同含量的蛋氨酸铜，探讨毛皮品质、血清生化指标、器官指数及相关酶的活性等指标变化情况，为乌苏里貉饲粮中铜含量的最佳水平提供建议值，为貉的饲养标准提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲养管理饲养试验在中国农业科学院特产研究所长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站进行。随机选取(135±5)日龄、健康、体重相近((6.32±0.02)kg) 的雄性乌苏里貉105只，随机分成7组(对照组和Ⅰ~Ⅵ组)，每组15只，单笼饲养。所有试验动物常规免疫、单笼饲养，每日07: 00与15: 30各饲喂1次，自由饮水。预饲期7 d，正式试验60 d。
1.2 试验设计与试验饲粮试验采用单因素试验设计，各组基础饲粮相同，分别添加蛋氨酸螯合铜(C10H20S2N2O4Cu)0(对照组)、30(Ⅰ组)、45(Ⅱ组)、60(Ⅲ组)、75(Ⅳ组)、90(Ⅴ组)、200(Ⅵ组) mg·kg-1，试验所用蛋氨酸螯合铜购自秦皇岛市三晶新农饲料有限公司，含量为12%(以铜元素计)。各处理组饲粮实际铜含量为4.1(对照组)、34.1(Ⅰ组)、49.1(Ⅱ组)、64.1(Ⅲ组)、79.1(Ⅳ组)、94.1(Ⅴ组)、204.1(Ⅵ组) mg·kg-1。
试验参考狐NRC(1982)[11]及大中型养殖场中生产实践中应用效果较好的乌苏里貉育成期各营养物质需要量，配制貉基础日粮，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
1.3.1 血清样品制备及生化指标测定 饲养试验结束时，每组随机选取8只健康乌苏里貉，活体空腹称重后采心血10 mL并处死，血液收集于促凝采血管中，经3 500 r·min-1离心8 min，将分离出的血清分装在1.5 mL编好号的Eppendorf管中，置于-80 ℃保存，备用。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、乳糖脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、血清葡萄糖(glucose，GLU)的测定采用试剂盒，以上试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司，按照试剂盒说明，使用VITALIB-E全自动生化分析仪测定。
血清中总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(copper and zinc superoxide dismutase，Cu-Zn SOD)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CER)活力的测定采用试剂盒，以上试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，按照试剂盒说明，使用紫外分光光度计测定吸光度并计算酶活力。
1.3.2 毛皮品质指标测定 乌苏里貉的体长是把处死的貉平放于水平地面上，鼻尖至尾根的距离。鲜皮长为貉皮去油后，上楦板，测量鼻尖到尾根的距离。测量貉皮重量为鲜皮重。之后平稳地在貉背中部取带毛囊的样本三束，分别放入自封袋内。带回实验室后，使用游标卡尺测定貉的针毛长与绒毛长，采用光学纤维直径分析仪测定貉背部针绒毛细度，以最粗部位直径进行数据记录
1.3.3 脏器指数测定 上述各组中8只乌苏里貉处死，取皮后迅速取出心、肝、脾和肾，用滤纸吸干脏器表面的血液后进行称重记录，然后计算各脏器指数：脏器指数=器官重量÷体重×100%。
1.3.4 肝中相关基因的实时荧光定量PCR1.3.4.1 肝总RNA提取与cDNA的合成 貉肝样品中的RNA提取使用TransZolUP方法，试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。使用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒按照试剂盒说明，进行反转录，反应体系为20 μL。
1.3.4.2 引物设计与合成 内参基因参照刘志蓝狐试验中的引物设计及参考犬类的mRNA序列，利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件设计相关基因特异性引物(表 2)。
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表 2 引物序列 Table 2 The primers sequences |
1.3.4.3 PCR扩增及检测 用合成的引物对貉肝CER、CHR、IGF-1与Cu-Zn SOD基因进行PCR扩增，扩增体系为50 μL：2×Es TapMasterMix(Dye) 25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O补至50 μL。扩增反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 2 min。PCR产物测定采用1.5%琼脂糖凝胶电泳。5 μL样品与上样缓冲液混合后点样，同时点Marker DL1000 5 μL；电压110 V电泳30 min后，紫外灯下观察，凝胶成像系统(Bio-Rad公司产品)采集图像。
1.3.4.4 实时荧光定量PCR 以各组貉肝的cDNA为模板，使用SYBR GreenⅠ嵌合荧光进行PCR，试剂盒采购自北京全式金生物技术有限公司。qPCR扩增反应体系(20 μL)：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Transstart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，ddH2O补至20 μL。qPCR扩增反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环。使用2-ΔΔCt法对目的基因的相对表达量进行计算。
1.4 数据分析试验数据通过SAS 9.4中单因素方差分析(one-way ANOVA)Duncan’s法进行显著性检验。P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉毛皮品质的影响铜水平对冬毛期乌苏里貉毛皮品质影响见表 3。Ⅲ与Ⅴ组体长显著高于对照组(P=0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ组鲜皮长显著高于对照组(P=0.04)。Ⅲ组针毛长显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ组针毛长显著高于对照组(P < 0.01)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组针毛细度显著高于对照组与Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ组，Ⅴ、Ⅵ组针毛细度显著高于对照组(P < 0.01)。鲜皮重、绒毛长与绒毛细各指标组间差异不显著(P>0.05)。
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表 3 饲粮铜水平对冬毛期期乌苏里貉毛皮品质的影响 Table 3 Effects of dietary copper supplemental levels on fur quality of fur growing Racoon dogs |
如表 4所示，饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉肝脏指数、心脏指数、脾脏指数与肾脏指数差异不显著(P>0.05)。Ⅲ组的肝脏指数最大，Ⅵ组的肝脏指数最小。
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表 4 饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉器官指数的影响 Table 4 Effects of dietary copper supplemental levels on organ index of fur growing Racoon dogs |
由表 5已知，Ⅵ组血清GLU浓度显著高于其余各组，Ⅴ组血清GLU浓度显著高于对照组与Ⅰ、Ⅱ组，Ⅲ组血清GLU浓度显著高于对照组与I组(P < 0.01)。血清ALP酶活各组间差异不显著(P>0.05)。Ⅵ组血清LDH酶活显著高于Ⅴ组，Ⅴ组血清LDH酶活显著高于对照组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.01)。Ⅵ组血清ALT、AST酶活显著高于Ⅴ组，Ⅴ组血清ALT、AST酶活显著高于对照组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.01)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ与Ⅵ组血清CER酶活显著高于Ⅱ组，Ⅱ组血清CER酶活显著高于Ⅰ组，Ⅰ组CER酶活显著高于对照组(P < 0.01)。Ⅴ与Ⅵ组血清T-SOD酶活显著高于Ⅰ组，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清T-SOD酶活显著高于对照组(P < 0.01)。Ⅴ与Ⅵ组血清Cu-Zn SOD酶活显著高于对照组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，Ⅲ、Ⅳ组血清Cu-Zn SOD酶活显著高于对照组与Ⅰ组(P < 0.01)。
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表 5 饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉血清生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary copper supplemental levels on blood serum biochemical indices of fur growing Racoon dogs |
用貉肝RNA反转录所得的cDNA为模板，进行PCR扩增，条带清晰，扩增结果长度符合引物设计预期大小(图 1)。日粮不同铜添加水平对貉肝CER、GHR、IGF-1与Cu-Zn SOD基因相对表达量的影响如图 2所示，Ⅴ与Ⅵ组的肝CER基因表达水平显著高于Ⅰ组，Ⅰ组肝CER基因表达水平显著高于对照组(P < 0.05)。Ⅴ组的肝GHR基因表达水平显著高于对照组(P < 0.05)。Ⅴ组的肝IGF-1基因表达水平显著高于对照组(P < 0.05)。Ⅴ与Ⅵ组的肝Cu-Zn SOD基因表达水平显著高于Ⅰ组，Ⅰ组肝Cu-Zn SOD基因表达水平显著高于对照组(P < 0.05)。
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图 1 目的基因PCR扩增产物电泳图 Fig. 1 PCR products of object genes |
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不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) The different small letters mean significant difference (P < 0.05) 图 2 铜水平对冬毛期乌苏里貉肝脏CER、CHR、Cu-Zn SOD与IGF-1基因相对表达量的影响 Fig. 2 Effects of copper supplemental levels on liver CER, GHR, Cu-Zn SOD and IGF-1 genes relative expression level of fur growing Racoon dogs |
毛皮品质是评价乌苏里貉经济效益的重要标准，而饲粮营养水平是其重要影响因素。其中，毛皮面积和被毛保温性能是衡量毛皮品质的重要标准。鲜皮长和体长的提升有助于获得最大的毛皮面积[12]，这可能与铜对貉有促生长作用密切相关[13]。毛皮重量和其延展性息息相关，当毛皮重量过轻时，延展性降低，本次试验中毛皮重量没有显著变化，可以推断，铜可以提升毛皮的面积，但不会影响毛皮的延展性。李道林[14]在兔的研究中发现，饲粮中添加铜会对生长性能及毛皮品质有着显著提升。Yang等[15]和程忠刚等[16]在猪的研究中发现，铜具有促进猪生长的作用，并且可以提升血清中IGF-1的含量。保温性能主要由被毛厚度相关，针绒毛的长度是决定被毛厚度的重要指标之一。本试验发现，饲粮中添加铜会提升被毛中针毛的长度，随着针毛长度的增加，针毛细度也随之增加[17-18]，并进一步提升了髓质腔容纳空气的能力。髓质腔内静止空气的量越多，被毛保温性能越好[19-20]。综上，饲粮添加适量铜可以增加体长和鲜皮长，从而提升貉的毛皮面积，提高针毛长度和细度，增加被毛厚度，使被毛保温性能得到提升。在本试验条件下，当饲粮铜添加水平为45~75 mg·kg-1时，可以得到最佳的毛皮品质。
3.2 饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉器官指数的影响脏器指数可以反映器官生长发育情况，以及机体的器官功能的强弱，也可表明机体的健康情况。铜广泛分布于各个器官，其中肝是铜代谢的主要器官，当铜积蓄过量时，肝会严重受损[21]。Kumar等[22]通过对大鼠饲喂高剂量铜的日粮发现，大鼠肾、脑以及肝都严重受损。此外有研究表明，铜缺乏会引起心外观肥厚，从而导致心肌病[23-24]，此外，铜缺乏还会导致脾萎缩[25]。本试验发现，貉对铜有较好的耐受量，当饲粮中铜添加水平为200 mg·kg-1时，脏器指数没有显著变化，对肝、肾、心和脾的功能没有影响。未添加组的心脏指数没有显著变化，说明饲粮中铜可以满足日常需要，不会产生心肌肥大、心肌病等。在小鼠与水貂等研究中也同样发现，动物机体对铜代谢调控能力较强，适当剂量的铜对脏器指数没有影响[26-27]。但李秀霞等[28]在小鼠中的研究中发现，饲粮中添加铜可以促进脾发育，具有延缓胸腺退化的功效。王宝维等[29]在鹅的研究中也发现相似结论。因此，在实践生产中，虽然，日粮中铜含量不会造成铜缺乏的现象，但是在不影响肾、肝和心代谢的情况下，可以适当提高饲粮中铜含量，有助于脾发育，延缓胸腺退化和提升机体免疫力。
3.3 饲粮铜水平对冬毛期乌苏里貉血清生化指标的影响机体的能量主要由GLU提供，为维持体内各组织器官的能量需要，GLU必需要保持动态平衡。本试验中貉血清中GLU浓度随着铜含量的升高而升高，这可能是由于Cu/Zn过高，抑制锌离子吸收，导致继发性缺锌[30-31]，而胰岛素分子中含有两个金属锌原子，缺锌会导致胰岛素失性，从而影响血糖代谢。ALP活力与骨骼发育和钙化密切相关，在生长阶段，ALP的酶活显著升高[32]，在冬毛期貉已经生理性成熟，骨骼停止发育，所以ALP的含量趋于稳定。LDH广泛分布于肝、心、脾、肾等细胞胞质中，是糖酵解通路的主要酶，常被用来检测心肌梗死、肝炎、肝硬化等疾病[27]。血清AST和ALT是肝功能检测的硬性指标，当机体肝硬化、肝中毒时，ALT与AST的血清酶活成倍上升[33]。在鹅研究中发现，当鹅饲粮铜含量超过400 mg·kg-1时，血清中LDH、AST与ALT的酶活明显上升，死亡率达到30%[34]。在小鼠的慢性铜中毒试验中也同样发现，血清中AST与LDH的酶活显著上升[35]。当饲粮中铜水平为90与200 mg·kg-1时，血清中LDH、AST与ALT的酶活呈倍数升高，证明高铜饲喂增加了肝代谢负担，造成肝细胞破损，使细胞中LDH等酶释放到了血清中。
Cu-Zn SOD与CER的活性中心由铜离子构成，对于清除机体自由基，抗氧化有着重要作用，CER能催化血液中的Fe3+ 还原成Fe2+, 还可以间接减少O2-生成[36]。Cu-Zn SOD是机体重要的抗氧化酶, 主要有清除O2-、保护组织细胞的作用[37-38]。本研究发现，饲粮中铜含量为60 mg·kg-1时，血清中CER、T-SOD与Cu-Zn SOD的酶活趋于稳定，随着铜水平的提升，其活力不会再有显著变化。有研究表明，在雏鸡饲粮中提高铜的含量，血清中Cu-Zn SOD与CER酶活上升[33]。刘强[32]也曾报道，在猪饲粮中提升铜的含量，血清中Cu-Zn SOD酶活也会随之升高。铜被小肠吸收，通过相关蛋白转运到肝中，引起肝中铜浓度升高，而肝是合成CER与Cu-Zn SOD的主要场所，间接增强了肝合成CER与Cu-Zn SOD的能力。T-SOD的酶活与Cu-Zn SOD酶活成正比，由于机体的Cu-Zn SOD酶活随着铜水平的升高，所以T-SOD的酶活也随之升高。因此，在饲粮中添加适量铜会提高抗氧化酶的酶活，增强机体清除自由基的能力。
3.4 饲粮添加铜水平对冬毛期乌苏里貉肝相关基因表达的影响动物生长发育主要通过生长激素轴的调控，其中GH至IGF-I途径是其中心环节，而GH只有与靶细胞上的GHR结合，通过细胞内的信号转导机制，使靶细胞分泌IGF-I，继而通过血液运输到组织器官，调控机体生长。肝是GHR基因表达量最高的器官，也是IGF-I分泌的主要场所。在生长阶段GH、GHR和IGF-1等基因的表达水平明显增高，血清中GH与IGF-I的含量显著高于其余生长时期[39]。Pierzchała等[40-41]对仔猪的研究发现，饲粮中提高铜的水平可以提高肝GHR与IGF-1基因的mRNA表达，进而提升血清中生长激素的水平。本试验结果显示，饲粮中添加铜使肝中GHR和IGF-1基因的mRNA表达含量显著高于未添加组。进一步证实，铜具有促进貉机体生长的作用。但是高铜饲粮使肝内GHR和IGF-1基因表达降低，与高铜可以抑制动物生长的结论相符[42]，这可能是由于铜与二价离子发生拮抗作用，使其继发性缺乏导致。血清中含铜酶的活力与饲粮中铜添加量密切相关，本试验结果表明，血清中CER与Cu-Zn SOD酶活随着铜水平的升高而呈现先升高，然后趋于稳定，CER与Cu-Zn SOD的主要产生场所是肝，通过对肝内的CER与Cu-Zn SOD基因的mRNA表达的检测，发现CER与Cu-Zn SOD基因的表达也呈现相似规律，进一步表明，饲粮中添加铜确实可以促进貉肝内CER与Cu-Zn SOD的合成。
4 结论本研究中，随着饲粮铜水平的升高，肝内GHR与IGF-1基因表达水平呈现先升高在降低的趋势，与貉的体长和鲜皮长的变化趋势相似，而在饲粮铜添加水平为45~75 mg·kg-1时，貉可获得最佳毛皮品质。而CER与Cu-Zn SOD基因的表达水平呈现先升高然后趋于稳定的趋势，当饲粮在60~75 mg·kg-1时，血清CER与Cu-Zn SOD活力达到平稳，此后，随饲粮铜水平的升高，两种酶的活力不会有显著变化。当饲粮铜添加水平为90~200 mg·kg-1时，血清中ALT、AST与LDH的活力急剧升高，表明饲粮中铜已经损伤貉肝等器官细胞，使细胞中的ALT、AST与LDH释放到血液中。综上所述，为提升貉的毛皮品质，抗氧化能力以及降低铜对貉机体的危害，建议貉饲粮中铜添加水平为60~75 mg·kg-1。
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