牦牛(Bos grunniens)主要分布于青藏高原及毗邻高海拔地区，有“高原之舟”的称号。现有牦牛1 400多万头，其中，90%以上分布在我国境内。牦牛是青藏高原牧民赖以生存的必要物种，在严峻的自然生长条件下，为牧民提供了维持生产、生活等的必需品，如肉、乳、毛、皮等^[1]。但是，牦牛的繁殖能力偏弱、生产性能低下、生长速度缓慢。青藏高原牧区生产方式比较落后，牦牛近亲繁殖的现象严重，许多品种逐渐出现退化。因其畜群周转的速度变慢，严重影响了牦牛群体的生产力水平。长期以来，牧民的不合理选种和繁育，导致畜群平均生产力极度下降、受胎率低、繁殖力下降，畜群结构极其不合理^[2]。此外，不同区域牦牛的用途存在一定差异，有些区域以乳用为主，期望群体中雌性个体为主导；有些区域以肉用为主，期望群体中雄性个体为主导。由此可见，以实际生产需求为导向，开展牦牛的性别控制意义重大，能显著提升牦牛的繁殖效率和市场价值。

性别控制技术可根据生产需求获得不同性别的后代。目前，效果最好且广泛应用的分离方法是流式细胞仪分选法^[3]。流式细胞仪分离X、Y精子的本质是根据精子大小以及物理或化学性质进行的筛选^[4]。由于X、Y精子的DNA含量存在差异，使之结合不同量的荧光染料Hoechst33342，当精子顺次排列通过流式细胞仪检测时，精子头部所携带的荧光染料被激发光束激发产生荧光，X精子结合的荧光染料较多，流式细胞仪为X、Y精子加上正电荷或负电荷，根据电荷的正负把X、Y精子分开^[5]。Bathgate等^[6]利用流式细胞仪分离羊X、Y精子，得到了羊的性控精液。Sales等^[7]利用流式细胞仪分离牛X、Y精子，采用人工授精技术检测分离精子的纯度，X精子受精后母犊的产出率为83%，Y精子受精后公犊产出率为90%。随着技术的进步，利用流式细胞仪分离精子的方法已经被多个国家商业化应用。但这项技术也存在分离效率低、分离成本高、受胎率偏低等问题。利用流式细胞仪分离精子时会浪费掉大量精子^[8]，其中包括多个方面的因素：分离过程中约有30%的精子因为不准确的定向无法产生正常的荧光信号而被丢弃；约有15%的精子因为X、Y精子的信号峰之间可能会产生重叠，不能准确地区分而被弃；精子分离的各个步骤中也会造成15%~20%的损失^[9]。这些因素都造成了分离精子效率较低，同时会在分离过程中浪费部分优质精子。此外，许多研究表明，分离精子的受胎率低于普通精液，可能原因是分离、冷冻等过程会对精子造成一定的损伤，影响精子受精的能力^[9-10]。

因此，如何提高流式细胞仪分离精子的效率、减少分离精子的浪费、提高分选后精子的活力等，对推广性控精液具有重要的意义。食物色素诱惑红属于单偶氮染料，由6-羟基-5-(2-甲氧基-5-甲基-4-磺酸盐-苯偶氮)-2-萘磺酸盐组成。它以暗红色粉末或颗粒的形式存在，易溶于水，被广泛应用于食品着色。低浓度诱惑红(< 1.25 mg·L^-1)对细胞无显著毒性，且无法进入细胞膜完整的细胞。本试验以流式细胞仪分选牦牛X、Y精子为基础，优化并建立高效的分选体系。通过添加诱惑红染料，与Hoechst33342共孵育精子细胞，显著提高了分选的效率。借助分子生物学技术对分选纯度进行鉴定，并结合体外受精技术，对分选后的X、Y精子分别进行受精，检测分选后的精子活力及进一步鉴定分选的纯度。本研究建立了一套高效的分选技术体系，为后期牦牛性控精液的制备及生产奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：流式细胞分选仪(MoFlo XDP，美国)，CO₂培养箱(Thermo，美国)，PCR仪(Eppendorf，德国)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，倒置荧光显微镜(Olympus，日本)，精子分析系统(AndroVision，德国)。主要试剂：DNA Taq聚合酶和DNA Marker均购自北京天根有限公司，荧光染料Hoechest33342(Sigma，美国)、诱惑红(Sigma，美国)、体外受精及胚胎培养液均购自Vitrolife公司(瑞典)。

1.2 精子细胞悬液的制备

本研究采用商品化牦牛冻精，将精液冷冻细管放入42 ℃恒温水浴中解冻30 s，用PBS稀释精液，400目滤器过滤。用Falcon管预先装入精子稀释液，使精子终浓度约为1.5×10⁸个·mL^-1。加入不同量(10 μL和20 μL)染色液(5 g·L^-1Hoechest33342)，用移液器轻轻吹打均匀，在温度38.5 ℃、CO₂浓度为5.5%、饱和湿度的CO₂培养箱中孵育。

1.3 流式细胞仪分选精子

本试验采用贝克曼流式细胞仪MoFlo XDP进行分选，所有分选步骤均严格遵守无菌操作。选用70 μm喷嘴，鞘液压力60 psi，分选流速控制在1×10⁴个·s^-1。将预先染色的精子样品放入进样仓，当X精子峰和Y精子峰在FL2通道的变异系数(CV值)小于2%时，开始精子分选。分别接收1×10⁷个X、Y精子，将精子接收管取出放入38.5 ℃的CO₂培养箱中备用。

1.4 单精子PCR扩增鉴定

分选所得的X、Y精子在显微镜下分离，分别随机各取50个，将单个精子加入1 μL碱性裂解液(500 mmol·L^-1 KOH，125 mmol·L^-1 DTT)中，置于65 ℃的水浴中裂解10 min，再加入10 μL的中和液(900 mmol·L^-1 Tris·HCl)混合均匀，即完成了基因组裂解及DNA提取，以雌、雄牦牛血液DNA为对照组。参考GenBank中已经公布普通牛(Bos taurus)的SRY及GAPDH基因序列，通过Premier 5.0软件设计引物，具体引物信息见表 1。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。PCR反应体系为15 μL：模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Premix Taq^TM DNA聚合酶7.5 μL，ddH₂O 4.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃ 5 min。采用2%琼脂糖凝胶进行PCR电泳检测。

1.5 精子活力检测

精子的活力决定受精率，对分选的牦牛X、Y性控精子进行活力检测，与分选前的精子比较，判定分选对精子活力的影响。从液氮罐中取出未分选的牦牛性控精液，在42 ℃恒温水浴锅中解冻，将精液从冻精细管中转至1.5 mL离心管中，放置于38.5 ℃的CO₂培养箱中平衡5 min。显微镜加热板开启预热，用移液器从平衡后的精液中取10 μL精液滴于载玻片，盖上盖玻片，置于精子分析系统下检测，记录数据并统计精子活力。

1.6 诱惑红孵育精子细胞

精子悬浮液的制备同上，染色液Hoechest33342与5 μmol·L^-1的诱惑红在38.5 ℃、CO₂浓度为5.5%，饱和湿度的CO₂培养箱中共孵育。1 000 r ·min^-1 离心收集精子细胞，PBS洗涤3次。用稀释液进行精子稀释，采用步骤“1.3”优化的分选条件进行X、Y精子分选。分选后用PCR技术检测分选精子的纯度，精子分析系统检测分选后精子的活力。

1.7 分选后精子的体外受精

牦牛卵母细胞收集及体外培养方法参考文献[2]。将成熟的COCs转移至预平衡的G-IVF清洗微滴中，清洗2~3次，然后，转移至预平衡的G-IVF受精微滴(50 μL)中培养，每个受精微滴放置20~30枚COCs。采用上游法精子获能，将分选后的X、Y精子移入盛有预平衡的精子获能液的底部，置于CO₂培养箱中获能40~50 min。获能后取适量上清转移至新离心管中，1 500 r ·min^-1离心5 min后弃上清，吹打混匀底部剩余的50 μL液体。将适量精子加入放置有COCs的G-IVF受精微滴中，精子浓度约为1×10⁴个·mL^-1，随后转移至CO₂培养箱中。共孵育20 h后，捡出受精的卵母细胞，转移至预平衡的G-1微滴(50 μL)中培养。每个微滴放置10~20枚卵母细胞，放置于38 ℃、CO₂浓度为5.5%、饱和湿度的CO₂培养箱中培养，72 h后换液。培养24与168 h后分别观察并统计卵裂率和囊胚形成率。

1.8 胚胎性别鉴定

收集各组囊胚期的胚胎，胚胎基因组的提取及PCR反应参照“1.4”。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，统计各组胚胎的性别结果。

1.9 数据统计与分析

所有组别的试验至少重复3次，SPSS 19.0进行ONE-WAY ANOVA检验，用SSR法进行多重比较，P＜0.05认为差异显著，P＜0.01认为差异极显著。

2 结果 2.1 优化牦牛X、Y精子的分选条件

检测不同染色时间、不同染色液用量对牦牛精子分选的影响。结果显示，当Hoechest33342染色液浓度为5 g·L^-1、精子染色时间为40 min、染色液用量10 μL时，X、Y区域占有比例最佳，形成两个明显的峰(图 1中蓝色峰)。此外，由表 2可知，用10 μL Hoechest33342染色40 min的精子回收效率最高，精子活力与20 μL Hoechest33342染色20 min组相当，显著高于其他组(P＜0.05)。

2.2 单精子性别鉴定

对分选后的牦牛X、Y精子进行单精子裂解，提取总DNA，应用Y染色体特异基因SRY的引物检测精子的性别，电泳结果见图 2。Y精子出现294和208 bp两条特异性条带，而X精子只有唯一的208 bp条带。根据电泳结果，统计分选后精子的纯度，结果见表 3。

2.3 诱惑红对精子活力的影响

随机抽取分选后牦牛X、Y精子及未分选精子，进行活力检测(图 3)。结果显示，未添加诱惑红处理的精子，通过分选后得到的X和Y精子，其精子活力显著低于分选前的精子(P < 0.05)。添加5 μmol·L^-1诱惑红与Hoechest33342共同孵育精子细胞，显著提高了精子的活力，与分选前精子活力无显著差异(P>0.05)。

2.4 分选后X、Y精子的发育潜能

根据试验设计，连续采集3次牦牛卵巢，将每次收集得到的卵母细胞随机分成3组，分别用分选后的X精子、分选后的Y精子和未分选的精子受精，记录受精率和胚胎发育结果(表 4)。结果显示，分选后的X与Y精子组的受精率及囊胚形成率略低于未分选组，但差异不显著(P>0.05)。利用已优化的PCR扩增体系对各组胚胎性别进行鉴定，结果显示，各组的胚胎性别与精子纯度基本吻合。

3 讨论

经济动物性别的控制与畜牧业的发展有着密不可分的关系，是长期以来科研人员的研究焦点之一^[11]。目前，利用性控精液进行人工授精和性控胚胎生产，是比较有效的控制方法^[12]。通过此项技术，可以满足正常的畜牧生产需要，有效地提高生产效益^[13]。本研究利用流式细胞仪进行牦牛X、Y精子分离，优化并建立了一套高效的分选技术体系。运用分子生物学技术，检测了分选后精子及胚胎的性别，进一步验证了分选的效率与纯度。本研究通过添加诱惑红，与Hoechest33342共孵育精子细胞，能显著提高分选后的精子活力。

染料孵育是精子分选的一个重要技术环节^[14-15]。最常用的染色剂为Hochest33342，这种染料可以穿透细胞质膜且具有水溶性质，采用非嵌入方式与DNA双链上的小沟结合后，最大激发波长为350 nm^[16]。然而，同一物种的不同细胞类型或不同物种的相同细胞类型对Hochest33342的耐受性存在一定差异。用16.2 mmol·L^-1的Hochest33342孵育马的精子90 min，其分选后精子的活力和分选效率最佳^[17]。Clulow等^[18]利用Hochest3334染色马的精液，使其终浓度为55~90 μmol·L^-1，显著提高了分选效果及分选后精子的抗冻能力。曾有权等^[19]用5 g·L^-1 Hochest3334和25 g·L^-1食物色素处理猪精子约30 min，对分选后的精子进行人工授精，X精液产雌性率91.67%，Y精液产雄性率100%。在其他哺乳动物的精子分选中也发现Hoechst33342的最适浓度有一定差异，且分选后的后代动物会出现一些异常^[20]。尽管有关细胞毒性或由Hoechst33342染色精子导致胚胎发育异常的报道较少，但是精子暴露在Hoechst33342中的遗传毒性效应已达成共识。本研究采用5 g·L^-1 Hoechest33342染色液10 μL孵育牦牛精子细胞40 min后，其分选效果最佳。此外，本研究在精子分选前用食物色素诱惑红与Hoechest33342共孵育牦牛精子细胞。诱惑红只着色因膜破损的精子，将Hoechest33342荧光信号掩盖，导致激发光减弱，使该部分精子在分选时被废弃^{[3, 21]}。只有膜完整的精子才进入分离程序，可以显著提高分选后有活力精子的比例。

用于评价精子分离后纯度及活力的方法较多，有出生后代的性别比例鉴定法、胚胎性别鉴定评价法、流式细胞仪重分析评价法、FISH法与PCR评价法等^[22-23]。Fugger等^[15]研究表明，利用流式细胞仪分选人的X、Y精子并用于体外受精，统计其后代的性别，其中X精子受精所产后代女性占92.9%，Y精子受精所产后代男性占73%。Johnson^[22] 利用流式细胞仪分选猪精液，得到的性控精液用于人工受精，其所产后代母猪比例占74%，公猪比例占83%。此方法存在试验周期长，不能及时对结果优化的问题^[24]。用胚胎性别鉴定来评价精子分离的纯度，此方法准确度较高，许多试验均采取这种方法来评价精子分选的纯度^[25]。Monk和Handyside^[26]用胚胎细胞学评价鼠的性别控制，结果显示，雌鼠准确率为91%，雄鼠准确率为100%。但因显微切割的要求较高，不宜推广使用^[27]。胚胎分子生物学评价法依据对胚胎细胞中的Y染色体上特有的SRY性别基因的检测，以评价分选精子的纯度^[28]。检测到特异信号的判定为雄性，未检测到特异信号的则判定为雌性^[29-30]。此方法具有敏感、准确、快速等特点，是目前最常见的方法之一^[31-34]。本研究中，采用单精子PCR法对分选精子进行了纯度分析，结果显示，X精子纯度率为94%，Y精子纯度率为96%。为进一步验证分选后精子的活力，将分选后的精子进行体外受精，结果显示，分选前后牦牛精子的发育潜能差异不显著，且胚胎的性别与期望值基本吻合，表明所建立的流式细胞仪分选体系可靠。

4 结论

本研究通过流式细胞分选仪成功建立了高效的牦牛X、Y精子分选体系。分选后的X、Y精子纯度可达94%以上，分选后精子活力达到54%。本研究对牦牛产业的发展具有重要意义，尤其是为后期牦牛的性控精液制备及生产奠定了基础。