颗粒细胞(granulosa cells，GCs)作为哺乳动物卵巢的主要功能细胞，在卵泡发育过程中发挥至关重要的作用。卵泡发育起始于颗粒细胞的发育，窦前卵泡发育后期，颗粒细胞开始表达FSHR，可使雄激素转变为雌激素，促进卵泡发育，形成优势卵泡[1]。研究发现，卵泡在不同发育阶段都存在卵泡闭锁[2]，而卵泡闭锁受多种因素调节，其中卵泡颗粒细胞的凋亡就能够直接诱发卵泡闭锁[3-4]。
microRNA(miRNA)是一种细胞内源性长度约22~24 nt的非编码RNA，通过调控靶基因参与多种细胞过程，如细胞凋亡、分化和增殖[5-6]。利用高通量测序技术从不同物种的卵巢组织中鉴定出大量miRNAs[7-12]，研究发现其广泛参与原始卵泡募集[13-14]、优势卵泡选择[15]、颗粒细胞增殖分化[16]、甾体类激素的合成与分泌[17-19]、卵母细胞成熟[20]、排卵[21]以及黄体形成[22]等卵泡发育的各个环节[23]。miR-483-5p和miR-486-5p与人卵丘细胞的增殖和卵泡的发育相关[24]，miR-145影响转化生长因子β受体2 (TGFBR2)基因的表达进而调控始基卵泡的募集[13]，miR-150通过抑制类固醇合成急性调节蛋白(STAR)基因的表达影响类固醇激素的合成和分泌[17]。miR-214-3p可能通过靶向线粒体融合蛋白-2(MFN2) 和核受体5A1(NR5A1)调控猪颗粒细胞增殖和雌激素的合成[18]。因此，miRNA在动物卵巢周期性变化、激素合成和繁殖过程发挥重要调控作用。
miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，且在脊椎动物高度保守[25]。miR-200a和miR-141可能通过靶向CD36和肿瘤坏死因子α刺激因子-6(TNFAIP6)调控山羊的卵泡发育[26]，miR-200b可能通过下调GNAQ反馈调控GnRH的表达来调控绵羊的发情过程[27]。此外，敲除miR-200b和miR-429的雌性小鼠不排卵[28]，敲除miR-429a、miR-200a和miR-200b显著降低斑马鱼的精子运动[29]。miR-200s参与动物卵泡发育、发情周期、排卵及精子运动等生物过程，由此可见其与动物生殖密切相关。本课题组前期研究发现，miR-200s在小尾寒羊发情期和间情期卵巢中差异表达[30]。研究证实，miR-200b可以通过直接靶向结合磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)3′UTR抑制卵巢颗粒细胞(KGN)增殖[31]。本试验以miR-200b为研究对象，初步探索其对绵羊卵泡颗粒细胞增殖凋亡过程的影响，为进一步研究miR-200b对绵羊卵泡发育的调控机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料DMEM/F12培养基和胎牛血清FBS(Gibco，美国)购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)有限公司；CCK8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所(Dojindo，日本)；HiPerFect Transfection Reagent购自QIAGEN。miR-200b mimic、miR-200b inhhibitor、mimic NC、inhibitor NC由广州锐博生物科技有限公司合成。
1.2 绵羊miR-200b的生物信息学分析通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库查找各物种miR-200b的成熟序列。利用在线工具TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(hwz ttp: //www.mirdb.org/index.html)和miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)分别对miR-200b进行靶基因预测，将数据进行分析整理，利用在线工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)对靶基因进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。
1.3 绵羊卵泡颗粒细胞的分离培养绵羊(小尾寒羊)卵巢采自保定瑞丽肉食品有限公司。将采集的卵巢置于37 ℃生理盐水(含1%双抗)中运回实验室。75%酒精润洗消毒后，预热生理盐水洗涤3次，剪去多余脂肪和系膜，转至超净台。PBS洗3次，利用无菌刀片在无血清培养基中轻轻划破卵泡(3~7 mm)，使卵泡液混于培养基中。然后将混合液转移至15 mL离心管，1 500 r·min-1离心10 min，弃上清，PBS洗涤两次，加入2 mL DMEM/F12(1∶1)完全培养基(含10%胎牛血清，1%双抗和50 μg·mL-1丙酮酸钠)吹打混匀后接种于25 cm细胞培养瓶中，再加入3 mL完全培养基。最后置于37 ℃、5% CO2培养箱内预培养过夜。第2天清洗换液，继续培养至细胞汇合度达70%~90%时传代。
1.4 绵羊卵泡颗粒细胞的转染与增殖检测转染前以每孔2×104的密度将颗粒细胞接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，每组6个重复，37 ℃预培养。用opti-M分别稀释50 nmol·L-1 miR-200b mimic(过表达组)、mimic NC(mimic阴性对照组)和100 nmol·L-1 miR-200b inhibitor(抑表达组)、inhibitor NC(inhibitor阴性对照组)，低速漩涡混匀，加入0.75 μL HiPerFect Transfection Reagent，低速漩涡混匀，室温静置10 min，形成转染复合体。然后将转染复合体逐滴加至96孔板中。分别在颗粒细胞转染24、48和72 h后，每孔加10 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培养箱内孵育2 h，利用酶标仪检测吸光度(450 nm)，观察细胞增殖情况。试验重复3次。
1.5 引物设计采用茎环法设计绵羊miR-200b引物，其反转录引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCATCATTA，上游引物序列：GCCGAGTAATACTGCCTGG，下游通用序列：CTCAACTGGTGTCGTGGA，并以U6为内参基因。利用Primer 3.0软件设计其他基因的引物, 并通过NCBI中Primer-BLAST初步查验引物特异性。CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax及Bcl-2表达量的检测均以GAPDH为内参基因。引物均由通用生物系统有限公司合成，引物序列详见表 1。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 qRT-PCR primer sequences |
转染前，以每孔2.5×105的密度将颗粒细胞接种于6孔板，每孔2 300 μL细胞悬液，每组3个重复，37 ℃预培养。用opti-M分别稀释50 nmol·L-1 miR-200b mimic、mimic NC和100 nmol·L-1 miR-200b inhibitor、inhibitor NC，低速漩涡混匀，加入12 μL HiPerFect Transfection Reagent，低速漩涡混匀，室温静置10 min，形成转染复合体。然后将转染复合体逐滴加至6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养。转染48 h后，收集细胞培养液，PBS清洗细胞2次，利用TRIzolTM Reagent提取RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(宝生物)反转录成cDNA。首先除去DNA，反应体系：RNA 800 μg，5×gDNA Reaction Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase-free dH2O补至10 μL；42 ℃孵育2 min，4 ℃保存。然后进行反转录，20 μL反应体系：上述反应液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL，RNase Free dH2 O 4 μL。轻轻混匀，37 ℃孵育15 min，85 ℃加热失活5 s，产物－20 ℃保存。最后使用Forget-Me-NotTM EvagreenⓇ qPCR Master Mix(Biotium)进行qRT-PCR检测，反应体系：2×Forget-Me-NotTM qPCR Master Mix 10 μL，Forget-Me-Not EvaGreen ROX Reference Dye 3 μL，RNase-free dH2 O 4.2 μL，cDNA 2 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 5 s共40个循环。
1.7 数据统计分析数据均采用SPSS 22.0进行统计分析，使用GraphPad Prism进行作图。qRT-PCR数据采用2-ΔΔCT方法进行计算。结果以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。
2 结果 2.1 绵羊miR-200b生物信息学分析利用NCBI和miRBase查出各物种miR-200b成熟序列，其种子区域均为AAUACU，说明miR-200b核心序列在各物种间高度保守(图 1A)。利用3种在线工具TargetScan、miRTarBase以及miRDB分别预测出1 196、51和1 246个基因与miR-200b有靶向关系，并用Venny2.1在线网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对预测的结果进行交互绘制，如图 1B所示。其中，3个软件预测出25个共同靶基因。GO分析发现，这些靶基因主要富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程(图 1C)；KEGG分析发现，miR-200b除了参与癌症相关通路，还参与Ras信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路及雌激素信号通路等(图 1D)，且这些信号通路与细胞周期、细胞生物学过程及生殖过程相关。
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A.不同物种miR-200b成熟序列；B. miR-200b预测靶基因的韦恩图；C. GO富集分析；D. KEGG通路富集分析 A. miR-200b mature sequence of various species; B. Venn diagram of miR-200b predicted target genes; C. GO enrichment analysis; D. KEGG pathway enrichment analysis 图 1 miR-200b的生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of miR-200b |
从图 2中可以看出，与mimic NC相比，miR-200b mimic转染24 h颗粒细胞存活率并无显著变化(P>0.05)，但48和72 h细胞存活率均极显著降低(P < 0.01)；与inhibitor NC相比，miR-200b inhibitor转染24 h细胞存活率显著升高(P < 0.05)，48 h极显著升高(P < 0.01)，但72 h无显著变化(P>0.05)。随转染时间延长，各组细胞存活率呈“V”型变化趋势，且在48 h达到最低。因此，转染miR-200b可降低颗粒细胞存活率，抑制细胞增殖，并有一定时间效应，本试验选取转染48 h进行后续试验。
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*. P < 0.05；**. P < 0.01；***. P < 0.001。下同 *. P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001. The same as below 图 2 转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor及NC的颗粒细胞存活率 Fig. 2 The survival rate of granulosa cell transfected with miR-200b mimic, miR-200b inhibitor and NC |
转染miR-200b mimic组的miR-200b表达量是mimic NC组的1 391.50倍(图 3)，差异极显著(P < 0.001)；而mimic NC、inhibitor NC及miR-200b inhibitor组的miR-200b表达量基本接近，无显著差异(P>0.05)。
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图 3 miR-200b在卵泡颗粒细胞中的表达水平 Fig. 3 The expression level of miR-200b in follicular granulosa cells |
从图 4中可以看出，与mimic NC相比，转染miR-200b mimic极显著下调CDK4(P < 0.01)、CDK6(P < 0.001)及CCND1(P < 0.001)基因表达水平，显著下调CCND2基因的表达水平(P < 0.05)。表明，miR-200b可抑制细胞周期进程。
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图 4 转染miR-200b mimic和mimic NC的颗粒细胞周期相关基因表达水平 Fig. 4 The expression level of cell cycle related genes in granulosa cells transfected with miR-200b mimic and mimic NC |
从图 5中可以看出，与mimic NC相比，转染miR-200b mimic极显著抑制Bcl-2基因表达水平(P < 0.01)，而对Bax基因mRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。此外，转染miR-200b mimic极显著下调Bcl-2与Bax的比值(P < 0.001)。
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图 5 转染miR-200b mimic和mimic NC的颗粒细胞凋亡相关基因表达水平 Fig. 5 The expression level of apoptosis related genes in granulosa cells transfected with miR-200b mimic and mimic NC |
卵泡发育是一个复杂精密的周期性过程，颗粒细胞作为哺乳动物卵巢的主要功能细胞，其生长分化在卵泡发育过程中发挥关键性的作用。通过转录组测序技术，对1和8月龄湖羊的卵巢组织分别进行测序，鉴定出miR-200a、miR-200b和miR-200c为其中3个差异表达的miRNAs，且与1月龄湖羊卵巢相比，8月龄的表达量显著下调，说明miR-200s与绵羊卵巢发育息息相关[32]。通过构建和分析小尾寒羊间情期和发情期卵巢组织miRNA表达谱，筛选出这两个时期差异表达的miRNAs，经进一步分析获得miR-200a、miR-200b和miR-200c这3个显著差异表达的miRNAs，且在发情期较间情期均表达下调[30, 33]。本研究对绵羊miR-200b靶基因进行GO和KEGG富集分析发现，这些基因参与细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程，表明miR-200b调控细胞生物学过程。因此，本试验针对miR-200b对绵羊卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响进行了研究。
通过检测细胞存活率，发现各处理组均存在先降后升的现象，这可能与绵羊卵泡颗粒细胞和miR-200b转染时间相关。对于绵羊卵泡颗粒细胞，24 h转染时间较短，转染效率较低，72 h转染时间较长转染可能逐步失效，而48 h转染效果很显著，说明转染效率高，因此后续试验均选择转染48 h。通过检测miR-200b表达量，发现miR-200b mimic组极显著升高，而miR-200b inhibitor组和inhibitor NC组并无显著差异，可能是由于绵羊卵泡颗粒细胞inhibitor选用剂量较低，效果不理想，因此后续试验只选用了mimic及其NC处理组进行过表达研究。研究表明，miRNA影响颗粒细胞增殖和凋亡过程。miR-214-3p能够在转录和翻译水平上调细胞周期相关基因(Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E及CDK4)表达从而促进猪颗粒细胞增殖[18]，miR-16过表达促进颗粒细胞增殖，诱导细胞周期进程并抑制细胞凋亡[34]，而miR-379-5p过表达抑制颗粒细胞增殖[35]。本研究中，miR-200b过表达降低颗粒细胞存活率，并下调CDK4、CDK6、CCND1和CCND2基因表达，而上述4个基因参与细胞周期G1期的进程及G1/S期转化。因此，miR-200b通过抑制绵羊颗粒细胞G1期相关基因表达影响细胞周期，从而抑制细胞增殖。与本试验结果一致，He等[31]发现，过表达miR-200b可抑制人卵巢颗粒细胞(KGN)增殖。
Zhang等[36]对miRNA与颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的调控关系进行了综述分析得出，miRNA调控的卵泡闭锁主要是由颗粒细胞凋亡所致。miR-1275促进猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁并通过损害LRH-1/CYP19A1轴调控E2分泌[37]，miR-204-5p通过靶向Bcl-2调控大鼠卵巢颗粒细胞凋亡[38]。本研究中，miR-200b过表达能从转录水平抑制Bcl-2表达并极显著下调Bcl-2与Bax比值，促进绵羊卵泡颗粒细胞凋亡。Bcl-2家族调控细胞凋亡属于介导细胞凋亡的最重要途径——线粒体途径。Bax的过表达可以加速诱导颗粒细胞的凋亡，而Bcl-2基因过表达可以拮抗Bax基因，抑制卵泡膜细胞及颗粒细胞的凋亡，控制卵母细胞凋亡，进而延缓卵泡闭锁[39]。Bax/Bcl-2的比值可以揭示细胞的生长或凋亡情况[40]。颗粒细胞凋亡是导致发育期卵泡闭锁的关键因素[41-43]，本研究中，绵羊卵泡颗粒细胞Bcl-2/Bax比值降低，表明miR-200b促进了细胞凋亡，推测其可能对绵羊卵巢卵泡闭锁具有重要调控作用。
4 结论本研究结果表明，miR-200b通过降低颗粒细胞存活率抑制细胞增殖、促使细胞周期相关基因表达量降低、下调Bcl-2/Bax比值来抑制细胞周期并促进细胞凋亡进而调控绵羊卵泡颗粒细胞。
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(编辑 郭云雁)