2. 石家庄天泉良种奶牛有限公司, 石家庄 050200;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
4. 保定市农业局, 保定 071051
, LI Qiufeng1
, CAO Yufeng1, YAN Jinling1, LIU Taotao1, ZHANG Yixian1, LI Jianguo1, GAO Yanxia1, LI Shujing2, XIE Peng3, ZHANG Xiujiang4
2. Shijiazhuang Tianquan Elite Dairy Ltd., Shijiazhuang 050200, China;
3. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
4. Baoding Municipal Bureau of Agriculture, Baoding 071051, China
甲烷是主要的温室气体成分，其产生的增温潜势比二氧化碳高25倍[1]，甲烷对全球气候变暖的贡献率达15%~20%[2]。据报道，大气中动物甲烷的排放量约为8.0×107 t，反刍动物甲烷的排放量约占全球总量的15%，其中牛每年甲烷的排放量约占畜禽甲烷总产量的73%[3]。反刍动物排放的甲烷，不仅带来了严重的环境压力，同时也引起了6%~15%的饲料能量损失[4]。因此，利用营养调控技术减少反刍动物甲烷排放对于保护环境和提高饲料能量利用率具有双重意义。
多年来，降低甲烷排放、提高饲料转化率一直是反刍动物营养工作者的研究重点。降低瘤胃中甲烷产量主要通过两条途径：一是抑制甲烷菌的数量，降低甲烷的产量，如添加硫酸盐、亚硝酸盐，促进硫酸盐、亚硝酸盐还原菌在瘤胃内的生长，使其与甲烷生成菌竞争氢，以抑制甲烷菌的生长[5]，从而减少甲烷产生和排放，但是瘤胃中硝酸盐过量时，极易引起亚硝酸盐中毒，从而降低反刍动物的采食量[6]；二是营养调控瘤胃发酵模式，使其从乙酸发酵型转变为丙酸发酵型，减少H2的产生，从而降低甲烷产量[7]，例如：1)莫能菌素等离子型载体，能够改变瘤胃发酵类型使瘤胃微生物发酵转为丙酸发酵为主，抑制甲烷、二氧化碳等气体的产生[8]，但是长期、大量使用会造成动物生产性能下降、饲料转化率降低，甚至产生毒害作用[9]；2)丝兰提取物、皂素等植物提取物也可促进瘤胃微生物向丙酸发酵转变，有效抑制瘤胃内甲烷的产量[10-11]，但植物提取物种类繁多，作用机制不尽相同，多为短期效应[12]。
精氨酸(Arg)作为功能性氨基酸之一，可以改善N代谢、血管生成和促进生长发育，参与脂肪代谢，增强免疫功能[13]。目前，动物体内精氨酸的需要量往往被低估，但精氨酸在瘤胃中极易被降解，直接饲喂效果差，此外，精氨酸价格昂贵，而瘤胃保护型精氨酸经济效益不合算。N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)是N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutmate，NAG)辅因子的结构类似物，其瘤胃降解率较低，能促进内源精氨酸的生成，是精氨酸的潜在代替物。NCG可以使机体维持较高的精氨酸水平，同时又避免与赖氨酸等碱性氨基酸形成拮抗[14]，促进机体氨基酸平衡。氨基酸能够通过转氨基作用脱去氨基生成α-酮戊二酸和氨，前者氧化脱羧形成琥珀酰CoA，进入三羧酸循环，进而增加琥珀酸等有机酸的产量，从而促进丙酸生成[15]，最终影响甲烷的排放量。国内外关于NCG对肉牛生产性能、甲烷排放量的影响研究较少，本试验旨在研究添加不同剂量的NCG对荷斯坦奶公牛生长性能、瘤胃发酵和微生物区系以及甲烷排放量的影响，为生产实践提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验的时间与地点试验于2018年9—12月在保定市满城宏达牧业有限公司进行，正试期90 d，预试期7 d。
1.2 试验材料N-氨甲酰谷氨酸(NCG)购于亚太兴牧(北京)科技有限公司。
1.3 试验动物与试验设计本试验采用完全随机分组试验设计，选择体重(478±13.66) kg左右、健康、膘情正常的荷斯坦奶公牛45头，随机分成3组，每组15个重复，每个重复1头牛，散栏饲养。各组饲喂相同的日粮，Ⅰ(对照组)、Ⅱ、Ⅲ组每头公牛分别投喂0、15、25 g·d－1的NCG，试验各组蛋白与能量水平一致，试验日粮组成及营养成分见表 1。
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表 1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutritional levels of basic diet (DM basis) |
试验用奶公牛采用全混合日粮(TMR)饲喂，饲养管理一致。每天饲喂两次，自由饮水，定期消毒，每天打扫料槽，每周清洗水槽2~3次，保持水槽和料槽干净、卫生。为奶公牛提供洁净的水源和干净的休息场地。
1.5 渗透管及牛轭的制作[16]1.5.1 渗透管的制作与选择 1) 准备好液氮罐、扳子、渗透管、冰袋、六氟化硫气体、钢网、聚四氟乙烯膜、线手套等。将组装好的渗透管称重，重量记录为W1。
2) 将称好的渗透管放入液氮中，待管体温度和液氮温度一样时，取出渗透管并迅速充入SF6纯气体，当管壁结晶不再增多时，迅速将管帽封闭严实，室温下称重记录为W2。气体重量(W2-W1)＞1 g，即为合格的渗透管。
3) 将合格的SF6渗透管投放入已准备好的恒温水浴箱中，温度设为39 ℃，通入40 mL·min－1流量的氮气。
4) 每隔3 d称重，记录好渗透管的重量。
5) 统计好60 d所有渗透管数据进行线性回归分析。根据本试验的投放时间和在瘤胃内释放的天数最终选出12个渗透管，于采样前20 d投入采样牛的瘤胃中。预计试验结束时管内SF6剩余量＞300 mg，SF6的渗透速率＞2.8 mg·d－1。12个渗透管的数据见表 2。
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表 2 渗透管线性回归方程 Table 2 Liner regression equation of the permeate tube |
试验结束时管内剩余SF6重量(mg)=渗透管投放时SF6的重量(mg)-SF6的渗透速率(mg·d－1)*渗透管投放天数(d)。
1.5.2 牛轭及气体收集装置的制作 牛轭主要是根据荷斯坦奶公牛的大小，由三型聚丙烯管(PPR)经过截取，之后用热熔机连接。然后将二通阀(B-14DKM4-S4-A)固定到牛轭上，最后要保证牛轭的气密性。试验前检查每个集气装置的气密性。牛轭及牛龙头为本实验室制作，其他零件购于美国Swagelok公司。
1.6 生长性能的测定分别在试验前和试验末期晨饲前，试验牛空腹称重，用于计算平均日增重(ADG)；在试验期间每15 d连续3 d测定其采食量，采集鲜料、剩料于105 ℃烘4 h，待冷却至室温称重，计算干物质采食量(DMI)；饲料转化效率(F/G)等于平均日干物质采食量除以平均日增重。
1.7 样品的采集与处理试验末期，每组随机选取5头试验牛，采用口腔采样法，采集试验牛瘤胃液，每头牛抽取约200 mL瘤胃液，其中10 mL分装至无菌离心管中，用于测定瘤胃微生物区系，－80 ℃保存；余下瘤胃液用4层无菌棉纱布过滤后收集滤液，分装于10 mL离心管中，用于瘤胃发酵参数的评定。瘤胃液pH使用酸度计现场测定，氨态氮(NH3-N)(加入0.1 mL 6 mol·L－1盐酸固氮)、微生物蛋白(MCP)和挥发性脂肪酸(VFA)需当天前处理，将处理好的样品于－20 ℃保存。
采用SF6示踪气体色谱法测定反刍动物甲烷排放量。试验结束前20 d，每组随机选取4头食欲良好、健康的荷斯坦奶公牛，将已知SF6释放速率的渗透管投放至选出牛的瘤胃中。试验结束前3 d采集气体样。记录每次打开牛扼和关闭牛扼结束采样的时间，期间有值班人员，检查集气设备是否完好，及时更换牛轭。同时，每天于距地面50 cm处收集一管牛舍周围环境的气体样品做空白，从而矫正甲烷和SF6的浓度。
1.8 瘤胃发酵指标和微生物区系的测定使用UB-7型(美国)酸度计测定瘤胃液pH。NH3-N浓度参照冯宗慈和高民[17]的比色法进行测定。VFA参照王加启[18]的方法进行测定，色谱柱为HP-INNOWAX (30 m×0.32 mm)。MCP测定采用差速离心法和凯氏定氮法[19]。
对瘤胃液古菌的16S V9区进行高通量测序，引物序列为上游引物1106F：5′-TTWAGTCAGGCAACGAGC-3′；下游引物1378R：5′-TGTG-CAAGGAGCAGGGAC-3′。由北京诺禾致源科技有限公司代测。测序得到的原始数据进行低质量部分剪切, 进行拼接、过滤，得到有效数据。利用Uparse v7.0.1001软件[20]以97%的一致性(identity)进行OTUs(operational taxonomic units)聚类，然后用Mothur方法与SILVA132[21]的SSUrRNA数据库[22]对OTUs的代表序列进行物种注释。
用7890 A型气相色谱仪(美国Agilent Technologies)测定气袋中甲烷的浓度。以氮气为载气，用单点校样法进行测定(GC-system)[23]，甲烷采用ECD检测器测定；SF6气体送检中国科学院大气物理研究所CERN大气分中心代为检测，SF6采用FID检测器测定。反刍动物甲烷排放量的计算公式：
| $ {R_{{\rm{C}}{{\rm{H}}_{\rm{4}}}}} = \frac{{{R_{{\rm{S}}{{\rm{F}}_{\rm{6}}}}}}}{{6.518}} \times \frac{{\left[ {{\rm{C}}{{\rm{H}}_{\rm{4}}}} \right]}}{{\left[ {{\rm{S}}{{\rm{F}}_{\rm{6}}}} \right]}} \times {10^3} $ |
式中：RCH4是甲烷排放速率，单位L·d－1；RSF6是SF6的渗透速率，单位mg·d－1；6.518是SF6的密度，单位kg·m－3；[CH4]是样品气中甲烷的浓度，10-6(摩尔分数)；[SF6]是样品气中SF6的浓度，10-12(摩尔分数)。
1.9 数据统计采用SAS 9.4软件的MIXED模型进行分析，Yij=μ+Gi+eij，其中Yij是要测试的指标，μ是平均值，Gi是NCG添加水平的固定效应(i=0、15或25 g·d-1)，eij是残差。微生物菌群的相对丰度参照Cobellis等[24]的方法进行对数转换，以提高正态分布。用PDIFF矫正的Tukey模型进行多重比较。P＜0.05表示差异显著，P＜0.1表示有差异显著趋势。试验结果以平均值表示。
2 结果 2.1 日粮添加不同水平NCG对荷斯坦奶公牛生长性能的影响由表 3可知，日粮中添加不同水平NCG对荷斯坦奶公牛的试验末重及日增重无显著差异(P＞0.05)；干物质采食量呈线性下降(P＜0.05)，Ⅲ组显著低于Ⅰ组(P＜0.05)，与Ⅱ组差异不显著；与Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组的饲料转化效率分别改善了6.91%和7.91%(P＜0.05)。
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表 3 N-氨甲酰谷氨酸对荷斯坦奶公牛生长性能的影响 Table 3 Effect of N-carbamylglutamate supplementation on growth performance of Holstein bulls |
由表 4可知，不同试验组瘤胃液pH、NH3-N和乙酸浓度差异不显著(P＞0.05)。与Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组MCP浓度提高了22.91%和15.17%(P＜0.01)；Ⅱ、Ⅲ组丙酸浓度显著高于对照组(P＜0.01)；Ⅱ组总挥发性脂肪酸浓度显著高于Ⅰ组(P＜0.05)。
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表 4 N-氨甲酰谷氨酸对荷斯坦奶公牛瘤胃发酵的影响 Table 4 Effect of N-carbamylglutamate supplementation on rumen fermentation of Holstein bulls |
由表 5可知，各试验组，瘤胃古菌的覆盖度都超过99%，说明测序深度高，足以反映古菌菌群的多样性及丰富度。瘤胃古菌中香浓指数、辛普森指数三组之间没有显著性差异(P＞0.05)。Ⅲ组Chao1指数与ACE指数显著低于Ⅰ组与Ⅱ组(P＜0.01)，且线性降低(P＜0.01)，说明随着NCG添加量的增加，瘤胃中产甲烷古菌群落的丰富度逐渐下降。
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表 5 N-氨甲酰谷氨酸对荷斯坦奶公牛瘤胃古菌群落α多样性的影响 Table 5 Effect of N-carbamylglutamate supplementation on alpha diversity indexes of methanogens community in rumen of Holstein bulls |
添加不同剂量的NCG对肉牛瘤胃产甲烷菌区系中门、科、属水平上甲烷菌的菌群组成如表 6所示。在门与科水平的相对丰度进行分析，与对照组相比，添加15、25 g·d－1的NCG，广古菌门与甲烷杆菌科的相对丰度有线性降低的趋势(P＜0.1)。从属水平的相对丰富度进行分析，各试验组甲烷短杆菌属在瘤胃古菌中占绝对优势，相对丰度都≥80%，以Ⅲ组的甲烷短杆菌属最低，相对丰度为80.05%。甲烷球菌属的相对丰富度Ⅲ组显著低于Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.01), Ⅱ组显著低于Ⅰ组(P＜0.01)；甲烷丝状菌的相对丰富度Ⅲ组显著低于Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.01)，Ⅰ组与Ⅱ组差异不显著(P＞0.05)。
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表 6 N-氨甲酰谷氨酸对荷斯坦奶公牛瘤胃中产甲烷菌区系的影响 Table 6 Effect of N-carbamylglutamate supplementation on methanogenic flora in rumen of Holstein bulls |
由表 7可以看出，随着NCG添加量的增多甲烷排放量线性降低(P＜0.01)。与Ⅰ组相比，Ⅱ、Ⅲ组甲烷排放量分别降低了8.44%和10.51%(P＜0.01)。
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表 7 N-氨甲酰谷氨酸对荷斯坦奶公牛甲烷排放量的影响 Table 7 Effect of N-carbamylglutamate supplementation on methane emission of Holstein bulls |
精氨酸是一种功能性氨基酸，作为多胺和一氧化氮的前体物，在多个生理反应、代谢调控中起着重要作用。精氨酸能够促进动物体的尿素循环[25]，其代谢产物进入三羧酸循环，提高D-葡萄糖-6-磷酸含量，加速糖酵解溶液途径的新陈代谢，从而提高能量的利用效率[26]，能量充足进而动物采食量降低[27]。NCG是精氨酸的潜在代替物，能够促进内源精氨酸的生成，并保持体内较高的精氨酸水平[28]。本试验结果表明，添加NCG线性降低奶公牛的采食量，当添加量15 g·d－1时能改善奶公牛的饲料转化效率，说明添加15 g·d－1 NCG有可能通过增加奶公牛内源精氨酸的生成，有利于机体中脂肪酸和葡萄糖的氧化，提高细胞能量利用效率[26]，进而降低动物采食量。与黄雅莉等[29]在三黄鸡添加0.4%与0.5%的NCG的研究结果一致。
3.2 日粮添加不同水平NCG对荷斯坦奶公牛产瘤胃发酵的影响反刍动物瘤胃pH是反映瘤胃发酵状况的重要指标，在维持瘤胃内环境相对稳定中起主导作用。瘤胃pH处于5.5~7.5时为正常范围[30]。本试验中，荷斯坦奶公牛瘤胃液pH均处于正常范围，添加NCG不会影响奶公牛瘤胃正常发酵。饲粮中的蛋白质、非蛋白氮和机体内源氮在瘤胃中降解产生的NH3-N是瘤胃微生物代谢过程中的主要氮源，同时也是合成MCP的原料。瘤胃中MCP含量能够反映瘤胃微生物对蛋白质的利用程度，其合成效率与NH3-N浓度密切相关。Oba等[31]的研究表明，补充NCG能够促进尿素循环，提高瘤胃和十二指肠中NH3-N的利用，为微生物蛋白的合成提供了更多的氮源。本试验结果显示，添加NCG对NH3-N的浓度有降低趋势，显著增加了瘤胃微生物蛋白的含量，原因是NCG能够避免瘤胃中氨态氮降解造成的氮损失，使瘤胃微生物合成更多的MCP，这与刘建新[32]的研究结果一致。
VFA是饲粮中碳水化合物发酵的终产物，可为反刍动物提供能量。其中乙酸、丙酸和丁酸共占总VFA的95%[33]。NCG能促进瓜氨酸的生成[34]，瓜氨酸在一系列酶的作用下将精氨酸代琥珀酸分解为精氨酸和延胡索酸[35]，从而增加了延胡索酸的生成量。研究表明，延胡索酸能够增加纤维分解菌的多样性及数量，提高纤维分解酶活性、瘤胃中丙酸及总挥发性脂肪酸的浓度[36]。本试验每头动物添加15 g·d－1NCG，增加了乙酸浓度，显著提高了丙酸浓度。丙酸含量增多，减少了瘤胃内H2，从而减少瘤胃中甲烷的生成。
3.3 日粮添加不同水平NCG对荷斯坦奶公牛产瘤胃古菌的群落结构的影响反刍动物甲烷主要产生部位是瘤胃，原因是瘤胃中存在产甲烷古细菌。产甲烷菌是瘤胃中主要的耗氢微生物，隶属于广古菌门(Euryarchaeota)，合成途径主要有以下3种：一是氢营养型，以氢和二氧化碳为底物，可生成80%的甲烷[37]；二是VFA裂解，由甲酸生成18%的甲烷[38]，由乙酸生成3%~5%的甲烷[39]；三是甲基化合物合成，甲烷产生量少。目前，广泛存在于反刍动物瘤胃内的4个产甲烷菌属有甲烷杆菌属、甲烷短杆菌属、甲烷微菌属和甲烷八叠球菌属[40]。给奶牛饲喂月桂酸后甲烷短杆菌的含量占总古菌的70%，而当饲喂肉蔻酸及硬脂酸，甲烷短杆菌的含量达到92%[41]。本试验中，甲烷短杆菌为优势菌群，其次为甲烷球菌属。添加NCG后，甲烷短杆菌的相对丰度有所降低，甲烷球菌属显著降低。原因是添加NCG的荷斯坦奶公牛瘤胃中丙酸利用菌与产甲烷菌竞争氢气产生丙酸，减少了甲烷菌形成的底物，从而降低了甲烷短杆菌的相对丰度，降低了甲烷的产量。Danielsson等[42]研究表明，甲烷短杆菌的群落结构也与肠道甲烷排放有关。对瘤胃内产甲烷菌的作用机制尚需进一步研究。
3.4 日粮添加不同水平NCG对荷斯坦奶公牛甲烷排放量的影响甲烷是瘤胃中有机物质发酵的产物之一，减少甲烷排放量对保护环境及提高饲料利用率具有双重意义。反刍动物瘤胃内甲烷的产生不仅与产甲烷菌有关，同时饲养水平、采食量等都会影响其甲烷的产量。饲料中加入晶体氨基酸能够提高饲料效率和能量保留率。郭添福[43]研究表明，饲料中添加氨基酸时能够降低畜禽N2O与甲烷的排放。本试验结果表明，添加NCG线性降低了甲烷的排放量。分析原因有以下两点：一是添加NCG增加了瘤胃中丙酸的含量，利用了更多的H2, 从而减少了甲烷的生成；二是NCG能够促进机体内源精氨酸的生成，促进肠道发育，提高了胃肠道消化吸收的比例，影响肠道微生物的代谢物如甲胺、二甲胺等的产量[44]，从而降低甲烷产量。
4 结论本试验条件下，每头动物添加15 g·d－1 NCG能有效调控荷斯坦奶公牛瘤胃发酵, 15~25 g·d－1均显著降低甲烷排放量, 推荐添加量为15 g·d－1。
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