2. 贵州大学动物疫病研究所, 贵阳 550025;
3. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室, 贵阳 550025;
4. 贵州省畜禽资源遗传管理站, 贵阳 550025;
5. 都匀市农业农村局, 都匀 558000;
6. 黔南民族职业技术学院, 都匀 558000
2. Institute of Animal Diseases, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Guizhou Key Laboratory of Animal Diseases and Veterinary Public Health, Guiyang 550025, China;
4. Guizhou Province Livestock and Poultry Resource Genetic Management Station, Guiyang 550025, China;
5. Agriculture and Rural Affairs Bureau of Duyun City, Duyun 558000, China;
6. Qiannan National Vocational and Technical College, Duyun 558000, China
鼠伤寒沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，常对畜禽健康、公共卫生以及食品安全造成威胁，是世界公共卫生安全重点监测的原核生物。鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB是一种保守的Hfq蛋白依赖的非编码RNA，反式编码调节靶mRNA，与靶mRNA通过有限的并且不完美的碱基配对相互作用[1-2]，反式编码调控小RNA与靶mRNA之间互补配对区域通常为相邻的6~8个碱基[3]。研究发现小RNA GcvB调控某些编码氨基酸与短多肽的转移蛋白，包括ABC转移蛋白家族中的Dpp和Opp蛋白等[4]。GcvB控制大的转录后调节子，通过其保守的富含G/U的结构域R1影响约1%的沙门菌基因，抑制一些氨基酸生物合成基因的表达[5]。到目前为止，仅验证了约24种鼠伤寒沙门菌GcvB的靶基因[6-7]，仍有许多未知的靶基因有待发掘。
本研究通过TargetRNA2软件预测鼠伤寒沙门菌野生型菌株小RNA GcvB的直接作用靶标，并结合该菌株在敲除小RNA GcvB的情况下转录组数据产生的差异结果分析，采用荧光定量PCR检测的方法对相应基因的表达差异进行验证，筛选可能受小RNA GcvB调控的基因，为明确鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB的调控机制提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料野生型鼠伤寒沙门菌LT2 3409株和其gcvB基因敲除株10241株均由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠。细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqⅡ等，购自TaKaRa公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 TargetRNA2对GcvB靶标的预测登陆网站(http://cs.wellesley.edu/~btjaden/TargetRNA2/)，输入分析对象(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str.LT2)，GcvB R1区共识序列(GGTTGTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGCAATTGGTCTG)、R2区共识序列(ACTTCCTGTA)和R3共识序列(TACCCTGTCTGTCCATAGTGATTAAT)分3次输入，mRNA匹配区域为-70至+30 nt，sRNA窗口大小数值为13，最小杂交种子数为7，P值最大阈值为0.05，过滤尺寸值为400，点击搜索并导出结果，筛选评分较高的5个基因进行后续试验。
1.3 基于转录组KEGG与GO富集的分析基于前期鼠伤寒沙门菌gcvB基因敲除株转录组数据[8]，将转录组分析结果注释到KEGG数据库进行pathway富集并通过与GO数据库对比，定位相关基因，分析其涉及通路和细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)以及生物过程(biological process，BP)。
1.4 预测的靶基因荧光定量PCR验证登录GenBank (登录号: AE006468.2)设计预测的靶基因荧光定量PCR引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成并进行特异性检测。以3409株作为对照组，GAPDH为内参基因，提取培养至对数早期(OD600 nm≈0.5)的3 409株及10 241株的总RNA样本，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应，反应体系为SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)5.0 μL、上下游引物各0.3 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 2.4 μL；扩增条件为95 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，39个循环；每个样本3个重复，采用2-ΔΔCt法计算相应基因的转录水平，检测并计算当gcvB基因敲除时narY、yeaK、trpB、STM2732和iciA基因在转录水平产生的差异表达倍数，结合转录组测序结果进行分析。
2 结果 2.1 小RNA GcvB的潜在靶标预测TargetRNA2预测结果显示，杂交能量值最高的4个基因narY、yeaK、trpB和STM2732以及阳性对照基因iciA被预测到。除STM2732基因功能未知外，其他4个基因分别编码硝酸还原酶、细胞质蛋白、色氨酸合成酶以及精氨酸转运系统的转录激活因子。5个基因靶位点的预测结果显示，邻近narY mRNA翻译起始位点上游的区域与GcvB R2区形成了7个连续碱基的互补，其余4个mRNA通过富含CA的区域与GcvB富含GU的R1区连续或不连续互补，其中以trpB较为特殊，该匹配区域包含了5′UTR和CDS区(图 1)，结果表明，所选5个基因均能和GcvB产生至少7个连续的碱基互补，并且可能存在与此前研究不同的作用机制。
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图 1 小RNA GcvB与靶mRNA的预测靶位点 Fig. 1 Predicted target sites of small RNA GcvB and target mRNA |
KEGG数据库注释结果显示narY、yeaK、trpB、iciA基因分别富集到硝酸还原酶、Ala-tRNA(Pro)脱酰酶、色氨酸合酶β链和LysR家族转录调节因子几个通路。在细胞成分方面，narY基因还与细菌的细胞质、硝酸盐、还原酶复合物和细胞膜相关，而其他基因未富集到相关功能。在分子功能方面，narY、yeaK和trpB基因分别涉及硝酸还原酶活性、脯氨酸氨酰-tRNA连接酶活性和色氨酸合成酶活性。在生物过程方面，narY、yeaK和trpB基因分别涉及无氧呼吸、翻译保真度的调节和色氨酸合成(表 1)。结果表明，除STM2732基因功能未知外，narY基因与鼠伤寒沙门菌的无氧呼吸过程相关，yeaK基因与蛋白质翻译时脯氨酸的识别相关，trpB基因与色基酸的合成有关，iciA基因与精氨酸的转运有关。转录组数据分析结果显示，5个基因narY、yeaK、trpB、STM2732和iciA分别在gcvB基因敲除后转录水平相对上调1.1、1.5、1.5、7.6和1.4倍，功能未知基因STM2732表达差异最大，其余基因差异表达倍数均小于2，结果表明，除STM2732基因外，其他基因包括阳性对照基因iciA均未达到差异表达阈值，其差异性需进一步验证。
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表 1 KEGG和GO分析信息表 Table 1 KEGG and GO analysis information sheet |
荧光定量PCR引物的特异性经验证后符合要求。荧光定量PCR检测结果显示，包括阳性对照iciA在内的narY、yeaK、trpB和STM2732基因相比3409株均在转录水平表达上调超过2倍，经2-ΔΔCt法计算分析，narY、yeaK、trpB、STM2732和iciA基因分别上调3.4、9.8、12.1、18.37和5.4倍，5个基因所呈现的差异性高低趋势与转录组测序结果保持一致(图 2)，以上结果表明，荧光定量PCR方法检测基因的差异表达在敏感性上整体高于转录组测序方法，narY、yeaK、trpB和STM2732是本研究筛选到的受GcvB直接调控的最优选靶基因。
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试验组与对照组的相对差异表达倍数值为n，代入log2n公式所得 The relative difference between the experimental group and the control group is n, which is obtained by substituting the log2n formula 图 2 预测基因的荧光定量PCR验证结果 Fig. 2 Results of real-time PCR for predicted genes |
所有已经过验证的鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB的靶标中，70%的基因与细菌氨基酸的摄取和合成代谢相关，GcvB的功能也被假定为细菌节约能量[9]。TargetRNA2预测的5个基因在转录水平均表达上调，被假定为受GcvB的负调控。其中，narY与细菌的无氧呼吸有关[10-11]，鼠伤寒沙门菌作为需氧及兼性厌氧型细菌，当其处于营养过剩的状态时，可能会抑制不必要的能量消耗，所以当细菌处于有氧呼吸时，无必要的无氧呼吸过程将可能被抑制。trpB基因GO富集到色氨酸合成过程[12]，这与此前GcvB调控氨基酸的摄取和合成代谢两大功能不谋而合，通常GcvB作用于靶mRNA 5′UTR核糖体结合位点或位于其上游的区域，而预测结果显示GcvB与邻近trpB mRNA起始密码子的CDS区匹配，该机制较为少见。最近，Lalaouna等[13]通过MAPS试验结合生物计算验证了与大肠杆菌小RNA GcvB的靶基因asnB、ysgA、tcyJ、asnA、panD、nlpA和inaA，GcvB均与7个基因的mRNA CDS区不同区域产生碱基互补作用，并主导mRNA的降解或二级结构的释放。该研究支撑了trpB基因作为GcvB靶标的可能性。yeaK基因与脯氨酸氨酰-tRNA连接酶的激活有关[14]，该酶对基因的翻译有着极其重要的作用，基因要实现无错误的蛋白质合成，在于氨酰-tRNA与相应氨基酸能否正确定位。STM2732基因的功能未知，但其与GcvB假定的结合位点与已验证的iciA基因具有极其相似的地方，iciA mRNA与STM2732 mRNA起始密码子上游-1至-7 nt的区域完全相同，富含CA的区域与GcvB富含GU的R1区完全互补，因此，其与GcvB的相互作用机制可能与靶基因iciA相同。
4 结论本研究预测了4个鼠伤寒沙门菌小RNA GcvB的靶基因narY、yeaK、trpB和STM2732与GcvB的假定连续碱基匹配数均大于7。4个基因除STM2732功能未知外，其他分别与鼠伤寒沙门菌无氧呼吸过程、硝酸还原酶的激活、脯氨酸氨酰tRNA连接酶的活化以及色氨酸合酶的生成有关。荧光定量PCR验证了4个基因的表达受GcvB的抑制，假定受直接负调控作用。
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