2. 天津市畜牧兽医研究所, 天津 300381;
3. 陕西佰傲再生医学有限公司, 西安 710000
, LIU Yuhan1, MA Yi2, AN Xiaopeng1, ZHANG Yue1, ZHANG Meng1, WANG Jiangang1, DU Bin3, LI Guang1, CAO Binyun1
2. Tianjin Institute of Animal Science and Veterinary, Tianjin 300381, China;
3. Shaanxi Bio-Regenertive Medicine Co., LTD., Xi'an 710000, China
microRNA是一类与基因表达调控相关的长度约为22个核苷酸的非编码单链小RNA，可诱导靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译进一步发挥生物学功能[1-2]。研究发现，miRNA在乳腺组织发育、泌乳调节等方面起重要作用[3-5]，例如Let-7g-5p调控鼠乳腺细胞的分化和功能[6]，miR-106b对牛乳腺上皮细胞的乳脂代谢有调节功能[7], miR-26a/b调节奶山羊乳脂三酰甘油的合成[8]等。miR-92a作为较早发现的保守miRNA, 属于miR-17-92家族6个成熟miRNAs (miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a)中的一员，定位于人染色体13q31[9]。目前有关miR-92a的研究主要集中在肿瘤的潜在治疗靶点方面，例如胃癌[10]、骨肉瘤[11]、乳腺癌[12]、B细胞恶性肿瘤[13]，其参与调控癌细胞的增殖、凋亡与发生。miR-92a参与诱导多能干细胞iPSCs(induced pluripotent stem cells)[14]，抑制肾母细胞瘤细胞(Wilms tumor cells)增殖和迁移[15]，miR-92a的研究主要集中在调控肿瘤发生及细胞凋亡方面，但在正常哺乳动物乳腺组织中的研究尚未见报道。
关中奶山羊是陕西地区的优质乳用家畜[16]，本研究主要以关中奶山羊乳腺组织和山羊乳腺上皮细胞(GMEC)为研究材料。本课题组前期通过miRNA测序技术构建了奶山羊乳腺组织miRNAs文库[17]，结果显示miR-92a在泌乳初期的奶山羊乳腺组织表达量极显著高于泌乳中期(P < 0.01)，差异倍数(fold change)为2.2倍，由此推测miR-92a对山羊乳腺组织发育及泌乳机能具有潜在调控作用。为了验证这一假设，本试验进行了山羊miR-92a的相关功能研究。首先，利用实时定量PCR法检测奶山羊不同泌乳时期乳腺组织中miR-92a的差异表达；其次，采用MMT、EdU、流式细胞术等方法，检测miR-92a对山羊乳腺上皮细胞活力、增殖、凋亡及细胞周期的调控作用；进一步利用高通量测序技术，构建山羊乳腺上皮细胞miR-92a过表达转录组文库，筛选差异表达基因，通过GO terms分析及KEGG通路分析探索差异表达基因对乳腺上皮细胞的调控作用。旨在阐明miR-92a对关中奶山羊乳腺发育和乳腺上皮细胞增殖、凋亡的调控作用，并筛选与乳腺上皮细胞发育和分泌功能相关的基因，为深入研究奶山羊乳腺发育及乳脂、乳蛋白合成机制提供研究支撑。
1 材料与方法 1.1 试验动物本试验所用的山羊乳腺组织样采于杨凌区南卜村的奶山羊屠宰场。采集泌乳期山羊乳腺组织，将乳腺组织剪成5 cm3左右的组织块，4%多聚甲醛固定，用于制备石蜡切片；用DEPC处理水清洗乳腺组织并剪成1~3 cm3左右小块，装入冻存管，液氮保存，用于提取乳腺组织总RNA；剪去乳腺周围的脂肪、结缔组织，将乳腺组织块浸泡于含有双抗(100 IU·mL-1青霉素+50 mg·mL-1链霉素)的PBS缓冲液，立刻带回实验室，用于原代细胞培养。
1.2 试剂及仪器Opti-MEM、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司，Trizol试剂、Lipofectamine 2000脂质体购自美国Invitrogen公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，pMD19-T载体、反转录试剂盒、荧光实时定量(qRT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，细胞凋亡和周期试剂盒购自联科生物公司，EdU试剂盒购自广州锐博生物公司，PCR扩增仪(美国ABI公司)，凝胶成像仪(北京百晶公司)，实时定量PCR仪(CFX ConnectTM Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad, USA)，荧光显微镜(IX71, Olympus, Japan)。
1.3 试验方法 1.3.1 细胞培养采用组织块法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基在37 ℃、0.5%CO2的条件下培养细胞，具体细胞培养方法参照相关报道[18]。
1.3.2 山羊乳腺组织HE染色乳腺组织块经4%多聚甲醛固定、脱水透明、石蜡包埋后制成5 μm的切片。切片用二甲苯和梯度乙醇连续脱蜡至水后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色，中性树胶封片，显微镜观察切片，并拍照。
1.3.3 组织总RNA的提取采用Trizol法，按照RNA提取试剂说明书提取不同泌乳时期乳腺组织总RNA，用核酸定量仪检测提取的RNA的质量和浓度。
1.3.4 miR-92a颈环引物、qRT-PCR引物设计与合成根据山羊miR-92a成熟序列chi-miR-92a：TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT，应用Primer primer 6.0软件设计miR-92a颈环反转录引物、miR-92a定量PCR引物, 并以U6作为内参基因, 引物序列见表 1，引物由上海生物工程有限公司合成。
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表 1 miRNA定量PCR引物序列 Table 1 The sequences of primers used in this study |
将提取的乳腺组织总RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板通过qRT-PCR方法检测不同泌乳时期乳腺组织miR-92a的表达量。反转录步骤参照试剂盒说明书进行，反应条件为95 ℃ 60 min、85 ℃ 5 s。利用合成的cDNA为模板和特定的引物(表 1)进行实时定量检测，以U6为内参基因，使用PrimerScriptTMmiRNA qPCR Starter Kit Ver 2.0 (TaKaRa)试剂，每个样品3个重复，反应体系:1 μL Gol Forward Primer、2 μL Uni-miR qPCR Primer、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、2 μL cDNA、1 μL ddH2O。
1.3.6 mimics转染细胞及转染效率检测miR-92a模拟物(mimic)及其阴性对照(negative control, NC)均为双链，由上海吉玛基因公司设计并合成(表 2)。培养的山羊原代乳腺上皮细胞，接种于6孔板，待细胞达到70%~80%融合度时进行转染，转染前1 h将培养基换为无双抗无血清培养基。将miR-92a模拟物mimics、阴性对照NC用Lipofectamine 2000转染试剂转染到增殖期的乳腺上皮细胞。细胞转染24 h后采用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA的OD值和浓度后-80 ℃保存备用。反转录合成cDNA，用miRNA RT-qPCR法检测miR-92a的转染效率, 反转录及RT-qPCR方法参照“1.3.5”。
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表 2 miR-92a模拟物及模拟物对照(NC)序列 Table 2 The sequences of miR-92a mimic and NC |
细胞转染24 h后，收集细胞，PBS清洗细胞, 离心弃上清，加入1 mL预冷70%乙醇，4 ℃固定2 h。离心弃上清，加入500 μL碘化丙啶染色液，充分重悬细胞沉淀，室温避光孵育30 min后，用流式细胞仪进行细胞周期检测。
细胞转染24 h，用无EDTA的胰酶消化细胞，1 000 r·min-1离心5 min、PBS洗涤后弃上清，500 μL 1×结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞，每管细胞悬液加入5 μL Annexin-V FITC和10 μL Propidium (PI)，室温避光放置5 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3.8 MTT及EdU检测培养的GMEC按3×104 cell·孔-1的密度接种于96孔细胞培养皿中，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。将100 nmol·L-1的miR-NC、miR-92a模拟物分别转染GMEC, 分别在24、48 h，每孔加入50 μL 5 mg·mL-1的MTT，孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO, 混匀，使用酶标仪测定其570 nm波长的OD值。计算乳腺上皮细胞的相对活性。
细胞增殖试验使用Cell-lightTMEdU荧光显微镜检测试剂盒(锐博生物，广州)进行检测，将山羊乳腺上皮细胞接种至96孔板，3×103cell·孔-1，细胞转染mimics 24 h后，加入50 nmol·L-1的EdU培养基37 ℃孵育2 h，随后用4%多聚甲醛室温固定30 min，后续试验步骤参照EdU检测试剂盒说明书进行。在荧光显微镜(OLYMPUS)下观察EdU试验结果并拍照。
1.3.9 山羊乳腺上皮细胞转录组测序分析转录组测序流程包括RNA提取、RNA样品质量检测、文库构建、文库纯化、文库检测、文库定量、测序簇的生成以及上机测序。本研究的转录组测序及数据分析工作由北京金唯智公司完成。
1.4 数据统计分析使用SPSS 22统计软件中One-Way ANOVA进行方差分析与显著性检验，计量数据以x±s表示，差异显著性标准: P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。用2-⊿⊿Ct法分析实时定量PCR试验结果。EdU阳性细胞数据统计使用Image-Pro Plus 6.0软件进行统计分析。转录组数据分析是基于制造商的说明书(NEBNextⓇ UltraTM RNA Library Prep Kit for IlluminaⓇ)构建miR-92a mimics(MC)和NC组的测序文库后，对测序数据质量评估并对低质量数据进行过滤, 去除污染及接头序列。用Hisat(v2.0.14)将过滤后的测序Clean Data与参考基因组进行比对分析，用Asprofile v1.0将预测出的转录本可变剪切事件分别分类和进行表达量统计。利用Samtools(v0.1.18)进行mpileup处理获取各样本可能的SNV结果，然后用Annovar(v2013.02.11)分别进行注释。基因表达使用Htseq(V 0.6.1)计算，该软件通过RPKM方法计算基因表达量。使用DE Seq Bioconductor确定差异表达基因，通过Benjamini和Hochberg对具有不准确发现率的测量进行校正后，将基因的P值设定为小于0.05以探索差异表达基因。最后将差异表达基因进行GO(http://www.geneontology.org/)富集分析和KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)通路分析。
2 结果 2.1 miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织的差异表达qRT-PCR法检测miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织中的差异性表达，结果显示泌乳初期山羊乳腺组织中的miR-92a表达水平极显著(P < 0.01)高于泌乳中期(图 1)。光镜下，观察乳腺组织结构(图 2)，泌乳初期乳腺组织呈现大量成熟腺泡，乳腺上皮细胞在腺泡腔内壁均匀分布；泌乳中期乳腺组织布满大量形态各异、大小不一的腺泡，腺泡腔内可见大量乳蛋白、脂滴等分泌物。
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图 1 miR-92a在不同泌乳时期乳腺组织中的表达 Fig. 1 miR-92a relative expression in different stages of mammary |
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A.泌乳初期；B.泌乳中期；AV.腺泡；L.腺泡腔；EC.乳腺上皮细胞；C.结缔组织；标尺=200 A.The early-lactation mammary; B. The peak-lactation mammary; AV. Alveolus; L. Lumen; EC. Mammary epithelial cell; C. Connective tissue; Bar=200 μm 图 2 关中奶山羊乳腺组织HE染色和miR-92a检测 Fig. 2 HE staining of goat mammary gland tissues and the test of miR-92a |
miR-92a过表达GMEC, 分别在12、24、48 h用MTT法检测其细胞毒性，结果显示相对于NC组，GMEC活细胞数无显著差异(图 3A)。EdU阳性细胞染色试验结果(图 3B)显示，miR-92a过表达组处于增殖期的阳性细胞比值极显著低于NC组(P < 0.01)；EdU染色图像见图 3C。
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A.MTT法检测细胞活力；B.细胞增殖率统计(EdU/DAPI)；C. EdU染色试验结果(红色为EdU阳性细胞，蓝色为细胞核DAPI染色；标尺=100 μm) A.Cell viability was measured using the MTT assay; B. Cell proliferation rate; C. Cell proliferation was measured using EdU assay (Edu positive cells in red and DAPI staining in blue; Bar=100 μm) 图 3 MTT及EdU检测试验结果 Fig. 3 MTT and EdU test results |
miR-92a mimic和NC转染乳腺上皮细胞48 h后，采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期及细胞凋亡情况。细胞周期试验结果显示(图 4A)，处于S期的乳腺上皮细胞数miR-92a mimic处理组显著低于NC组, 而处于G1期的细胞数miR-92a mimic处理组显著高于NC组(图 4B)。细胞FITC/PI染色试验结果(图 4D)分析显示，miR-92a mimic处理组的凋亡细胞数显著(P < 0.05)高于NC处理组细胞(图 4C)。
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A.流式细胞周期检测；B.细胞周期分析；C.细胞凋亡率统计；D.流式细胞凋亡检测 A. Cell cycle was detected by FCM; B. The analysis of cell phases; C. Statistics of apoptosis rate; D. Cell apoptosis was detected by FCM 图 4 细胞周期及细胞凋亡检测 Fig. 4 The analysis of cell cycle and cell apoptosis |
将miR-92a mimics(MC)及NC转染到GMEC后提取细胞RNA，用RT-qPCR法检测miR-92a的转染效率, 结果显示，与NC组比较，miR-92a mimic处理组的miR-92a相对表达量上调40倍(P < 0.01，图 5A)。构建RNA文库进行转录组测序，对原始数据进行预处理，对低质量数据进行过滤，去除污染及接头序列后分别得到57 391 511及54 138 949个clean reads。将过滤后的测序数据与参考基因组进行比对分析，MC及NC组分别有92.342%及93.123%定位到基因组上。其中，在参考序列上有多个比对位置的测序序列占8%~9%，有唯一比对位置的占83%~84%(表 3)。对所有匹配的reads比对到基因组上的各个部分的情况进行统计，定位区域分为外显子(exon)、内含子(intron)和基因间隔区域(intergenic)，其分布情况如图 5B所示。样品间基因表达水平相关性是检验试验可靠性和样本选择是否合理性的重要指标。此次测序相关系数R2值分别为0.998及0.98(图 5C)，表明生物学试验操作是可重复的且变异不大。
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A. miR-92a模拟物转染效率检测；B. Reads在参考基因组不同区域的分布情况; C. RNA-Seq相关性检查 A. Transfection efficiency test of miR-92a mimic; B. The distribution of reads in the reference genome; C. RNA-Seq correlation test 图 5 测序数据可靠性分析 Fig. 5 Reliability analysis of sequencing data |
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表 3 部分参考基因组序列读取数据 Table 3 Summary of partial sequence read alignments to the reference genome |
对检测的结果按照差异显著性标准(差异基因表达变化2倍以上且FDR≤0.05)进行筛选，统计基因显著性差异表达的上下调情况(图 6A)，结果显示有214个基因表达差异显著，其中有54个下调，160个上调(图 6B)。与NC组相比，MC组下调的差异表达基因有PSAT1、PSPH及INHBE等，上调的差异表达基因有TGFB2、IGFBP3及PRLR等(表 4)。
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A.差异基因MA plot图(横轴代表表达量的高低，纵轴代表差异表达的倍数；红色点表示上调显著差异因，蓝色点表示下调；FC.差异倍数；Counts.比对到每个基因的reads的条数)B.显著差异基因数据统计(上调基因160个，下调基因54个) A. Differential expression genes MA plot (Red dots indicate the significant differences in up-regulation, blue dots indicate down-regulation; FC. Fold change; Counts. Number of reads matched to each gene); B. Statistical data of significantly different expression genes (160 genes up-regulated, 54 genes down-regulated) 图 6 差异表达基因统计 Fig. 6 Differential expression gene statistics |
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表 4 部分差异表达基因列表 Table 4 The list of partial up-regulated and down-regulated genes |
为了进一步分析预测得到的差异基因参与的生物学过程，对其进行基因功能(Gene Ontology, GO)分析。图 7显示总共有392个GO terms，其中差异基因在生物过程(biological process)中有262个(66.8%)，细胞组分(cellular component)中有52个(13.3%)，分子功能(molecular function)中有78个(19.9%)。在生物过程中富集差异基因最多的GO terms有多细胞生物过程(multicellular organismal process)、单细胞生物过程(single-multicellular organism process)及发展过程(developmental process)；在细胞组分中富集最多的GO terms有细胞外区域(extracellular region)、细胞外区域部分(extracellular region part)及蛋白质性细胞外基质(proteinaceous extracellular matrix)；在分子功能中富集最多的GO terms有结合(binding)、金属肽酶活性(metallopeptidase activity)及生长因子结合(growth factor binding)。
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纵坐标为富集的GO term，横坐标为该term中差异基因数;  生物过程、 细胞组分、 分子功能
Vertical axis is the enriched GO term, Horizontal axis is the number of expressed genes per term; biological process; cellular component; molecular function
图 7 GO富集分析柱状图
Fig. 7
GO enrichment analysis
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通过KEGG通路分析进一步了解差异表达基因相互协作以执行其生物调节的功能。KEGG富集程度通过Rich factor、Q value和富集到此通路上的基因个数来衡量。富集图显示共有51条KEGG通路可能对乳腺上皮细胞有重要调控作用。其中，钙离子信号通路(Calcium signaling pathway)、细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、肿瘤信号通路(Pathways in cancer)、刺激神经组织的受体配体交互(Neuroactive ligand-receptor interaction)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)及MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)是最富集的6条通路(图 8)。而Ras信号通路(Ras signaling pathway)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)及TGF-β信号通路(TGF-beta signaling pathway)也是值得注意的富集通路，这都显示miR-92a可能对奶山羊乳腺上皮细胞的代谢具有重要的调控作用。
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纵轴表示通路名称，横轴表示富集因素, 点的大小表示此通路中差异表达基因数多少 Vertical axis is the pathway name, horizontal axis is the Rich factor. The size of points indicates the number of differentially expressed genes in this pathway 图 8 差异基因KEGG富集散点图 Fig. 8 The KEGG point diagram of differential gene Rich distribution |
乳腺发育与乳的合成主要受细胞因子及神经内分泌系统激素所调控[19-20], 研究发现miRNA对哺乳动物乳腺发育及乳合成具有重要调控作用。本试验主要研究了miR-92a在奶山羊乳腺组织及乳腺上皮细胞中的功能，旨在阐明miR-92a对乳腺发育及乳腺上皮细胞增殖和凋亡的调控作用。试验结果显示miR-92a在泌乳初期山羊乳腺组织中极显著高于泌乳中期(P < 0.01)，此结果与本课题组前期乳腺组织miRNAs高通量测序结果一致，初步证明miR-92a对奶山羊乳腺发育及泌乳周期具有潜在调控作用。与NC组比较, miR-92a处理组乳腺上皮细胞的增殖率极显著降低(P < 0.01)；且miR-92a处理组细胞的凋亡率显著增高(P < 0.05)；细胞周期结果显示miR-92a处理组处于S期的细胞显著低于NC组，而处于G1期的细胞显著高于NC组。结果证明miR-92a具有抑制乳腺上皮细胞增殖，促进乳腺上皮细胞凋亡的作用。乳腺上皮细胞的数量和分泌活性与奶山羊的泌乳性能息息相关，因此增加乳腺上皮细胞数量，增强细胞活力和增殖能力，减少细胞凋亡将有助于奶山羊乳腺的发育、提高乳腺上皮细胞泌乳机能。
为进一步探索miR-92a对乳腺上皮细胞泌乳机制的调控作用，本研究采用RNA-seq技术建立了miR-92a及NC的山羊乳腺上皮细胞mRNA文库，筛选过表达miR-92a处理组与NC组乳腺上皮细胞的差异表达基因。乳腺上皮细胞是乳腺组织中具备合成及分泌乳成分的功能细胞，乳腺组织中除乳腺上皮细胞、纤维细胞、肌细胞外还含有大量脂肪和结缔组织。有别于多数已报道的有关哺乳动物乳腺组织转录组测序研究[21-22]，本试验选择的测序材料为纯化的山羊乳腺上皮细胞，针对乳腺上皮细胞的测序数据较乳腺组织测序数据更加精准且纯粹。结果显示下调基因54个，上调基因160个，这些基因与乳腺的发育和生理循环具有相关性。其中，下调的差异表达基因有PSAT1、PSPH及INHBE等，研究表明，PSAT1调节丝氨酸的生物合成作为糖酵解途径的媒介参与丝氨酸的生物合成，其活动广泛分布在各个组织，调控细胞增殖[23]。PSPH是HAD家族中的一员，作为氨基酸、神经递质、磷脂、糖脂等多种化合物的生物前体，它与各种细胞行为有关，如脂质体的合成，细胞的增殖和分化[24]。INHBE属于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族，参与多种生物活动。上调的差异表达基因有TGFB2、IGFBP3及PRLR等。TGFB2是TGF-β超家族的重要成员之一，调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生理过程[25]，它通过经典的TGF-β-Smad2/3信号通路发挥其生物学功能[26]。胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白3(IGFBP3)通过IGF信号通路参与细胞分化、增殖和凋亡，在细胞和生物体的生长调节中起重要作用[27]。PRLR作为催乳素(PRL)受体位于细胞膜表面，PRL与其结合并启动相应的细胞内信号转导过程，从而实现其生物学功能[28]。例如，PRLR在垂体PRL与乳蛋白基因的信号转导过程中起核心作用，PRLR通过与PRL结合后启动JAK2/STAT5信号途径，激活反式作用因子STAT5，启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用元件的靶基因的表达[29]。此外，在GO terms的分析中，这些受miRNA调控的基因主要涉及的功能与乳腺发育过程中的一些分子机制确实有一定的联系。KEGG信号通路分析发现细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、VEGF信号通路及TGF-β信号通路是差异表达基因主要的富集通路[30-32]，而这些都与乳腺的生长发育及乳的合成息息相关。进一步研究将依据转录组测序结果，筛选泌乳相关通路中的关键基因并进行功能验证。
4 结论奶山羊乳腺组织中，miR-92a的表达量在泌乳中期显著低于泌乳初期，miR-92a促进GMEC的凋亡且抑制细胞增殖。在miR-92a过表达组中检测到160个上调基因和54个下调差异表达基因，GO terms及KEGG通路分析表明，这些差异表达基因参与多种生物学进程，进一步说明miR-92a可能参与调控乳腺发育及泌乳性能。本研究初步探明miR-92a在乳腺上皮细胞中的增殖和凋亡调控作用，挖掘潜在的泌乳相关功能基因，为进一步研究奶山羊乳腺细胞分泌及合成机制，进而改善奶山羊乳成分品质提供相应的理论依据。
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