马驽巴贝斯虫(Babesia caballi)是马梨形虫病的病原之一，由硬蜱传播引起马属动物贫血、黄疸和死亡的顶复门血液原虫病[1-2]，马梨形虫病主要分布在热带、亚热带区域，给马饲养业和国际马运动发展带来极大的威胁[3-6]。新疆作为半农半牧地区，有大量珍贵的马资源，马和传播媒介蜱更容易接触，导致该病频繁发生、流行，对当地的马产业造成了极大的经济损失[7-9]。
目前为止，马努巴贝斯虫病已经有了多种检测方法，补体结合试验(complement fixation test，CFT)对于早期(急性)感染的检测是准确的，但敏感性较低[10]。间接免疫荧光抗体试验(indirect immunofluorescent antibody tests，IFAT)用于检测马驽巴贝斯虫病，展现了高特异性，但是同样缺乏敏感性。IFAT是国际动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)推荐的马梨形虫病规定测试之一，但通常，IFAT是用来辅助分析CFT结果。随着近代分子生物学的发展，马驽巴贝斯虫病的检测手段主要有临床诊断、血液涂片、血清学诊断及普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法等。PCR诊断以其高敏感性和特异性越来越受到人们的关注[11]，但是面对基层马群“携带者”抗体检测仍需要血清学检测方法。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)也被广泛用于检测寄生虫感染，该方法在与单克隆抗体联合使用时特异性和灵敏性会达到很高的水平，且操作简便，结果直观[12]。
Bc48基因是马驽巴贝斯虫裂殖子棒状体蛋白，相对分子质量为48 ku，被认为是血清学抗体检测的重要抗原，根据棒状体蛋白制备的单克隆抗体，显示抑制寄生虫的生长[13-14]。已经使用针对Bc48产生的单克隆抗体开发了用于检测马驽巴贝斯虫竞争ELISA[15]。这些发现表明Bc48及其单克隆抗体可能是马驽巴贝斯虫血清学诊断的候选者。
马驽巴贝斯虫病在大多数国家都有发生。该病的有效检测对于新疆马产业的发展起着至关重要的作用。马驽巴贝斯虫Bc48基因是该虫重要的保守基因，研究表明，该蛋白是一种重要的免疫蛋白质[16]，该基因在国内外已经被用于ELISA诊断方法的研究且特异性良好，是诊断马驽巴贝斯虫病的重要抗原[17-18]。本研究利用马驽巴贝斯虫新疆地方株Bc48基因的原核表达产物和针对该基因制备的单克隆抗体，建立CI-ELISA检测方法，为当地马驽巴贝斯虫病的检测、监控提供参考依据，为综合防控奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物、细胞、重组质粒及血清BALB/c雌性小鼠(6及10周龄)购自浙江大学实验动物中心；骨髓瘤细胞(SP2/0)由浙江大学动物科学学院农业部重点病毒实验室提供；pET-28a-Bc48重组质粒为先前制备，保存于新疆农业大学寄生虫实验室；马血清样品来自新疆伊犁哈萨克自治州昭苏军马场。
1.1.2 试剂质粒小提试剂盒购自TIANGEN公司；胎牛血清购自四季青公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自KPL公司；RPMI-1640粉剂购自Gibco-BRL；聚乙二醇(50% polyethylene glycol-4000)，50×HAT、100×HT均购自Sigma；竞争ELISA(c-ELISA)商业试剂盒购自美国VMED公司。其他试剂均为进口及国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 免疫原的制备及动物免疫重组质粒的转化及目的蛋白纯化、小鼠免疫见参考文献[19]。
1.2.2 抗Bc48蛋白单克隆抗体的制备及鉴定在无菌条件下取出小鼠脾，用聚乙二醇(PEG-4000)将小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。选择效价高、抑制率好的阳性克隆进行3~4次亚克隆试验，获得能稳定分泌Bc48抗体的杂交瘤细胞株。收集腹水用辛酸硫酸铵法及protein G进行纯化，测量浓度并分装保存于-80 ℃，同时对该单克隆抗体进行鉴定，具体操作步骤见参考文献[20]。
1.2.3 CI-ELISA试验条件的优化 1.2.3.1 方阵滴定试验确定最佳包被浓度和单克隆抗体最佳稀释浓度① 将抗原加入到pH=9.5的碳酸盐缓冲液(CBS)中，使其浓度为6 μg·mL-1，在此浓度基础上进行2倍倍比稀释至0.1 μg·mL-1，并设置零浓度孔作为对照，将7个浓度梯度的溶液以100 μL·孔-1的剂量加入酶标板中4 ℃过夜包被；②选择稀释倍数高的单克隆抗体分别稀释至2×104、4×104、8×104、1.6×105、3.2×105、6.4×105、1.28×106及2.56×106倍，将8个浓度梯度的单克隆抗体稀释液纵向加入已包被好的酶标板中；③测定OD450 nm值，选取OD450 nm接近于1.0的值，且与上、下两孔的OD450 nm值相差较大的孔，所对应的即是最佳抗原包被浓度及单抗最佳稀释浓度。
1.2.3.2 试验对封闭液及显色时间进行优化，测定各孔OD450 nm值并取平均值，每个条件设置3个重复，选择OD450 nm在1.0左右为最佳封闭液[21]。对血清作用时间及血清稀释度进行优化，测定各孔OD450 nm并取平均值，N/P值最大为血清最佳稀释度[22]。
1.2.3.3 临界值的确定用已建立的CI-ELISA方法对20份马驽巴贝斯虫阳性马血清、30份马驽巴贝斯虫阴性马血清进行检测，确定其临界值[22]。
1.2.3.4 重复性试验用同一批次及不同批次纯化的Bc48抗原包被酶标板，对3份马驽巴贝斯虫阳性血清及3份马驽巴贝斯虫阴性血清进行检测，每个样品2个重复，计算血清抑制率的变异系数确定CI-ELISA变异系数的范围[23]。
1.2.4 特异性试验运用建立的CI-ELISA方法检测马泰勒阳性血清及马驽巴贝斯虫阳性血清各3份，根据血清抑制率，判定该方法的特异性。
1.2.5 符合率试验根据已优化的CI-ELISA反应条件，对90份马血清样品，进行CI-ELISA及c-ELISA检测试剂盒进行检测，结果以商品化试剂盒结果为标准，计算二者的符合率。对结果不一致的样品，以试剂盒结果为准[23]。
2 结果 2.1 单克隆抗体的制备与鉴定 2.1.1 实验动物免疫血清效价测定第4次免疫10 d后尾尖采血，分离血清，间接ELISA检测小鼠血清效价达到104，选取效价最高的小鼠进行加强免疫，3 d后制备脾细胞。
2.1.2 单克隆抗体制备及鉴定通过细胞融合及亚克隆试验共筛选出3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为11F4、7F4、1H2。用无菌液体石蜡致敏小鼠，注射杂交瘤细胞株，收集、纯化腹水。对单克隆抗体进行亚型鉴定，发现11F4与7F4抗体亚型为IgG2a，1H2亚型为IgG1，且三株单抗的轻链均为κ链。
2.2 CI-ELISA反应条件的确定通过对抗原包被浓度，单抗稀释度，封闭液，血清稀释度、作用时间，酶标二抗稀释度，底物最佳作用时间，确立如下操作步骤：①酶标板每孔加入100 μL 0.19 μg·mL-1蛋白，4 ℃包被过夜；②每孔加入200 μL洗涤缓冲液(PBST)洗涤5次；③加入200 μL 1% BSA，37 ℃封闭1 h，洗涤同上；④每孔按1:10加入待检血清，37 ℃孵育30 min洗涤同上；⑤1:3.2×105加入竞争抗体11F4，37 ℃孵育30 min，洗涤同上；⑥按照1:8 000加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育45 min，洗涤同上；⑦每孔加入100 μL TMB底物溶液，37 ℃反应10 min；⑧每孔加入50 μL 2 mol·L-1 H2SO4；在450 nm处读取各孔OD值。
2.3 临界值的确定20份阳性马血清抑制率I>45%为20份，30份阴性血清中26份血清I≤35%，4份血清35%＜I≤45%，确定I>45%为阳性、I≤35%为阴性、35%＜I≤45%为可疑血清。
2.4 CI-ELISA方法评测情况 2.4.1 重复性试验根据公式计算出批内变异系数为1.2%~5.0%。批间变异系数为2.5%~6.6%，说明建立的CI-ELISA方法特异性良好。
2.4.2 特异性试验3份马泰勒虫病阳性血清抑制率均低于35%，表明该方法特异性较好，见表 1。
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表 1 CI-ELISA特异性结果 Table 1 Results of specificity test for CI-ELISA |
对采集的90份马血清，分别使用建立的CI-ELISA和c-ELISA试剂盒进行检测，两者总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%，见表 2。
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表 2 CI-ELISA方法与c-ELISA试验的检测结果 Table 2 Results of comparison test between CI-ELISA and c-ELISA kit |
CI-ELISA检测马驽巴贝斯虫抗体比其他血清学方法(CFT、IFAT)[12, 24-25]、ELISA方法更加敏感，操作简单，结果清晰，适合大规模的检测[26]。本试验在前期构建原核、真核重组质粒的基础上首次对新疆马驽巴贝斯虫地方流行株Bc48基因进行单克隆抗体的制备，纯化抗原免疫小鼠成功制备出3株稳定分泌抗Bc48的单克隆抗体[19]。
单克隆抗体的制备是建立CI-ELISA方法的关键，本试验从所制备的3株单抗效价及IFA分析，最终选取11F4单抗应用于CI-ELISA试验。参与CI-ELISA试验反应的成分较多，蛋白非特异性结合的原因可影响CI-ELISA试验结果，因此本试验对不同浓度、不同种类的封闭液进行筛选，最终确定1% BSA为最佳封闭液，同时通过条件筛选也确定了蛋白包被浓度为0.19 μg·mL-1、单抗最佳稀释度为1:3.2×105、血清作用时间为30 min及血清最佳稀释度1:10、酶标二抗最佳稀释度1:8 000、底物最佳显示时间为10 min。经重复性、特异性、符合性试验最终确定了较稳定、特异的CI-ELISA检测方法。对采集的90份马血清进行检测，结果表明该CI-ELISA方法与标准c-ELISA试剂盒，总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%，表明该方法符合性良好，可用于马驽巴贝斯虫病抗体的检测。CI-ELISA检测方法的建立为新疆马驽巴贝斯虫的监控提供技术支撑。为临床“带虫宿主”的筛查、对该病的预防、诊治起到一定作用，为我区、我国马梨形虫病的综合防控奠定基础。
4 结论基于马驽巴贝斯虫重组Bc48蛋白及其单克隆抗体建立的CI-ELSIA方法可用于检测血清中马驽巴贝斯虫病抗体，其检测速度快，对试验要求不高，安全便捷，短时间内可以检测大量样品，非常适合基层大批临床样品检测，为患马努贝斯虫病马体内抗体水平继续监测与检测试剂盒的开发奠定基础。
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