2. 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所, 合肥 230031
, TANG Jishun1,2, ZHANG Zhuangbiao1, LA Yongfu1, LIU Qiuyue1, DI Ran1, WANG Xiangyu1, CHU Mingxing1
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China
受精是哺乳动物有性生殖最重要的环节。随着体外受精技术和细胞生物学的发展，受精过程越来越清晰，但是受精的分子机制并不特别明晰。因此，精卵融合一直是一个神秘的现象。2005年，Inoue等[1]鉴定出一种精子表面蛋白Izumo1，并证明这种蛋白与精卵结合相关。但是在2005年以后的9年时间里，卵子表面相应的受体一直未被发现。直到2014年，发现卵子表面的Juno蛋白与受精过程相关，Juno被认为是Izumo1在卵子表面的受体[2]。Izumo1和Juno的相互作用是精卵识别所必需的[3]。它们是目前发现的第一个精子和卵子质膜上的配体-受体蛋白对。
1 哺乳动物的受精过程有性生殖的方式保证了几乎所有真核生物的持续繁衍。而由雄性和雌性产生的两种在形态学上完全不同的细胞的相遇和结合，可以形成完全全新的个体。这两种单倍体的细胞，精子和卵子，在母体的繁殖管道(在哺乳动物中是输卵管)中相遇、识别、融合而成为新的二倍体，进而发育为一个崭新的生命体。
受精是哺乳动物有性生殖最重要的环节，这是一个膜识别和融合的过程，已有许多相关研究[4]。目前已知，精子进入雌性生殖道后，经过获能、穿越卵丘细胞、结合到卵子的透明带、触发和完成顶体反应，之后才能和卵子融合，完成受精。顶体反应(acrosome reaction)是受精的先决条件。顶体是覆盖于精子头部细胞核前方、介于核与质膜间的囊状细胞器。顶体反应是指精子获能后，与卵相遇时，顶体开始产生的一系列改变[5]。一般认为，卵丘细胞和透明带是诱发产生顶体反应的主要因素。顶体反应的过程包括顶体受体的激活、顶体膜与精子质膜融合、顶体中水解酶的释放、透明带的水解(形成一条精子入卵的通道)等。透明带可以介导物种特异性的受精作用。透明带是防止多精入卵的第一条屏障，受钙离子调节。体外培养条件下，Ca2+、K+及高蛋白培养液能诱发及促进顶体反应。人透明带(zona pellucida，ZP)由4种糖蛋白(zona pellucida glycoprotein)组成：ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。最初，研究者认为，ZP3可以充当配体使精子结合到透明带上[6]。后来的研究证明，人ZP1、ZP3和ZP4都可以与精子结合并诱导顶体反应[7]。而2010年Gahlay等[8]在《Science》发表的文章指出，精子在卵细胞透明带表面的结合并不足以诱导精子发生顶体反应，精卵的识别取决于ZP2的分裂状态。科学家猜测，顶体反应发生后，精子进入卵周隙，这第二次的精卵膜识别和膜结合还需要借助精子和卵子表面的多蛋白复合体进行，最终导致精子质膜与卵细胞质膜的融合[9]，从而完成受精过程，形成二倍体的受精卵[10]。
2 精子表面蛋白Izumo1的发现有许多候选蛋白可能参与精子和卵子的融合，但没有一个能通过基因敲除小鼠得到证实[9]。其中一个候选蛋白是致育蛋白(Fertilin)，一种由Fertilin α(ADAM1b)和Fertilin β(ADAM2)组成的受体样异二聚体蛋白质[11]。Fertilin α和Fertilin β分别具有疏水融合肽样序列和用于整合素黏附的ECD基序。有人提出，Fertilin β的ECD基序识别卵母细胞上的整合素，然后精子利用Fertilin α的融合肽样序列快速与卵母细胞融合[12]。Fertilin β基因敲除小鼠表现出雄性不育，然而显微分析发现，敲除Fertilin β小鼠的精子形态正常，精子的数量和运动性也没有受到影响，并且能发生正常的自发顶体反应和精子获能，此外，卵子与Fertilin β-/-精子可以发生质膜融合，完成减数分裂，形成第二极体，其精卵融合发生率与Fertilin β+/+精子融合的发生率相同，表明精卵质膜融合不需要Fertilin β。而体外精子结合试验结果表明，Fertilin β-/-精子不能黏附在透明带上。此外，Fertilin β-/-雄性小鼠交配后，野生型雌性小鼠的输卵管中很少发现Fertilin β-/-精子。结果表明，Fertilin β-/-雄性不育的主要原因不是质膜融合失败，而是精子无法与透明带黏附且从子宫向输卵管的迁移发生障碍[13]。敲除Fertilin α基因的雄性小鼠仍能生育。因此，Fertilin显然不是精卵融合必不可少的因素[14]。早在2001年，科学家就认为卵细胞膜上的CD9和受精中的膜融合过程相关[15]，但是精子表面与融合相关的因子仍然未知，同时人们对精卵融合的详细分子机制知之甚少。
2005年，Inoue等使用了一种抑制融合的单克隆抗体，鉴定出与小鼠精子融合相关的抗原。这种抗原是一种新型的免疫球蛋白超家族成员。这种精子表面的蛋白以日本的婚姻神殿命名为“Izumo”[1]。研究者制备了Izumo缺陷型的小鼠，Izumo-/-双等位基因敲除的小鼠是完全健康的，并且母鼠可育。但是Izumo-/-双等位基因敲除公鼠的精子因缺乏Izumo不能与卵子结合，从而导致不育[1]。尽管这些公鼠能产生形态正常的精子，这些精子也可以和卵子识别结合并进入透明带，但是却没有办法和卵子融合。
一般来说, 不同物种的精子和卵子是不能识别和融合的，但是作为一个特例，叙利亚金色仓鼠(Mesocricetus auratus)的卵子可以和人精子识别和融合。在临床上这被用来作为检测精子质量的方法[10]。人的精子也有Izumo，使用人Izumo的抗体可以使得人的精子不能和去除透明带的仓鼠卵子融合[1]。说明如果精子缺少这种Izumo蛋白就不能和正常的卵子融合，而无法完成受精过程。
精子的表面配体蛋白在受精前是隐藏的，在雌性的输卵管中精子将其表面的配体蛋白展示在精子表面，从而发生顶体反应，使得精卵结合顺利发生[16]。受精后卵膜和透明带发生生物化学改变，使得卵子不能接受别的精子，而减少产生不能存活的多倍体[17]。有一些受体蛋白被认为和精卵的识别和融合过程相关[18]，如卵子表面的CD9[19-22]。重组的Izumo1可以和CD9缺陷型的卵子结合，也可以和野生型卵子结合。说明CD9并不是Izumo1在卵子表面相应的受体蛋白。而尽管这个Izumo1蛋白似乎应该在卵子上有一个相应的受体蛋白，但是在2005年以后的9年里，这个卵子上的受体一直未被发现，因而Izumo1也被戏称为“光棍蛋白”[23]。
3 卵子表面蛋白Juno的发现2003年之前的研究发现卵子上的磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol, GPI)式受体对于受精是必须的，不论通过酶学的方法还是遗传学方法移除这些受体都会使得卵子不育[24-25]，但是哺乳动物配子识别和融合的分子机制，尤其是卵子方面的研究并不清楚。这可能是因为卵子是一个非常稀有的细胞类型，很难获得人的卵细胞来作为研究材料，且很难溶解出卵子表面的膜嵌入蛋白。而精卵结合时受体和配体的结合过程又是在瞬时的自然条件下发生的[26]，使得研究的难度很大。Bianchi等[2]发明了一种新技术可以鉴定低亲和性的细胞外相互作用，他们用这种方法来研究哺乳动物的精卵识别过程，终于发现在卵子表面的Juno与受精过程相关。
2014年4月，Bianchi等[2]在《Nautre》发表的文章指出，叶酸受体4蛋白(folate receptor 4, Folr4)是哺乳动物卵子上的受体，该受体可以和精子上的Izumo1蛋白特异性结合，完成精卵识别的过程，使精子进入卵子完成受精。Folr4是一个在卵子表面表达的GPI锚定蛋白，是3种叶酸受体之一。在小鼠中这几种受体被认为和叶酸的吸收相关。在小鼠中，Folr4表达于CD4+和CD25+调控的T细胞上，可以在抗肿瘤治疗中被检测到[27-29]。同时，Folr4也调节食用叶酸后的生理反应[30-31]。但是之前并没有报道过卵子中Flor4的功能。Bianchi等[2]的试验表明，这种Folr4虽然序列和叶酸受体家族(folate receptors, FRs)相似，但与Folr1和Folr2不同的是，重组的Folr4蛋白并不能和叶酸结合。可能因为与Folr1、Folr2相比，Folr4与叶酸结合的关键氨基酸区域的结构不同，使得Folr4不能与叶酸结合[32-33]。因而，用Folr4来命名这个基因并不合适，Bianchi等[2]建议将Folr4以罗马婚姻女神“Juno”命名，这也就是Juno蛋白。
4 Izumo1与Juno的基因和蛋白信息Izumo基因家族有4个成员：Izumo1、Izumo2、Izumo3和Izumo4[34]。这4个成员的N端结构域明显同源，并被命名为“IZUMO结构域”。其中Izumo1特异在精子上表达[35]，Izumo1~3是睾丸组织特异性表达的跨膜蛋白，Izumo4是在包括睾丸在内多个组织中表达的可溶性蛋白[36]。小鼠Izumo1对于配子融合是必需的，同样Izumo1也在人[37]、猪[35]、绵羊[38]等哺乳动物受精过程中表达。
Izumo1基因在人、小鼠、猪、牛、绵羊、山羊上分别定位于19、7、6、18、14和18号染色体上。人Izumo1基因目前已发现的有3个不同的可变剪切体，分别长1 621、1 020、1 183 bp(数据来源于NCBI数据库)。Xing等[38]克隆了绒山羊(capra hircus)和绵羊(ovis aries)Izumo1的cDNA和基因组DNA。对绵羊和山羊4.6 kb的Izumo1序列进行分析，发现8个外显子拼接的963 bp典型开放阅读框(open reading frame，ORF)。绵羊和山羊Izumo1基因在DNA和蛋白质水平上具有99%以上的同源性，并且与牛、小鼠、大鼠和人的同源性也很高。Juno基因在人上定位于11号染色体，在小鼠和猪上定位于9号染色体，在牛、绵羊、山羊上定位于15号染色体。人Juno基因目前已发现的一种转录本长753 bp(数据来源于NCBI数据库)。Juno在多种组织中都有表达。
人的Izumo1是具有大胞外区的I型跨膜蛋白，由一个螺旋束IZUMO结构域、一个保守的8个半胱氨酸簇和一个N-糖基化免疫球蛋白样结构域，以及一个短的胞质区的尾巴组成。IZUMO结构域包括一个中心β-发夹区域，为Juno结合提供了主要平台[37, 39]。Xing等[38]通过生物信息学分析表明，15种哺乳动物中Izumo1蛋白序列的排列显示出几个高度保守的区域，包括LDC和YRC基序与半胱氨酸残基以形成潜在的二硫键桥、Ig样结构域上游的CpnkCG基序、假定的N-连接糖基化位点上游的Gltdysfyrvw基序和一些分散的Cys残基。这些独特的特征对于精确定位重要的基因基序和功能非常有用。然而，C端区域在物种间的变异更大。山羊、绵羊和奶牛的Izumo1 cDNA序列在很大程度上是同源的，分子系统发育分析与它们的形态学分类相一致。
人Juno蛋白结构和其他叶酸受体家族成员类似，8个α-螺旋(α1-α8)和4个β-链(β1-β4)形成一个单球状褶皱，保守的8个二硫键起到稳定结构的作用。Juno与FRs的序列高度一致(~60%)，与FRs中叶酸结合口袋相对应，Juno也有一个疏水口袋。Juno的疏水口袋由6个结构段组成(L0~L4区域和α3螺旋)。尽管形成叶酸结合口袋的大多数疏水残基在Juno中很保守，但它对叶酸没有任何亲和力[39]。
5 Izumo1与Juno在精卵融合过程中的相互作用Juno被认为是调节哺乳动物受精过程最重要的关键因子。Juno缺陷的卵子不能够和正常的精子融合，导致Juno缺陷的母鼠不育。Izumo1和Juno的相互作用在几种哺乳动物中都是保守的，比如人、小鼠、猪、负鼠[2, 40]。
Jean等[41]制备了人Juno蛋白的单克隆抗体，在表达人Juno蛋白的细胞中，这种抗体可以和重组的人Izumo蛋白产生竞争性结合。利用这些人Juno蛋白抗体进行免疫染色，发现在人卵细胞质膜上存在Juno蛋白，而且在人卵细胞的成熟过程中，Juno蛋白一直有表达。Suzuki等[42]也发现，Juno蛋白在卵细胞GV期表达，而且可以持续表达到MII期。Juno也会在MII期的第一极体膜上表达。在卵细胞中注射siRNA可以抑制Juno蛋白在卵细胞膜上的表达，但是MII期卵细胞上Juno的表达量不受siRNA影响。在人Juno蛋白抗体存在的情况下，对去透明带的人卵细胞进行人工授精无法成功发生受精作用，也说明Juno蛋白确实和人的受精过程相关，在配子膜融合过程中起决定作用[41]。但是在老化的卵母细胞膜上Juno的丰度会下降，同时皮层颗粒金属蛋白内切酶Ovastacin在老化的卵母细胞中会过早分泌和错误定位，导致透明带蛋白ZP2分裂，从而使得受精能力大幅度下降[43]。Young等[44]用CRISPR/Cas9技术在小鼠Izumo1基因上制造了一个点突变，使得Izumo1蛋白在翻译过程中提前终止，获得的截短型Izumo1蛋白没有细胞质内的区域，只保留了胞外区。这种小鼠拥有正常的繁殖能力，但是Izumo1蛋白的表达量减少了，暗示胞外区和繁殖能力相关，而细胞质区和表达量相关。
精子蛋白Izumo1和卵子受体Juno的识别结合实际上是一种黏附作用，这种黏附作用在人和小鼠的卵子中都是保守的[45]。精子进入透明带后，Izumo1与Juno黏附，卵子上的CD9在精卵融合前在细胞间聚集，CD9被认为是与Juno合作的蛋白[9]。卵子表面的Juno蛋白在黏附作用后会进入小泡并释放到卵膜外。在发生精卵融合的40 min之后，就不能在卵膜表面检测到Juno蛋白了。这种Juno蛋白的脱落是一种梯度反应，在40 min内就可以完成。Juno蛋白的脱落机制与防止多精子进入卵细胞有重要关系，保证卵子在自然情况下只能和一个精子融合(图 1)[23]。最新的研究也发现，在受精失败和多精子症的妇女中发现了4个Juno基因的SNPs，Juno的变异可能在受精失败和多精子症的发病机制中起作用，这些罕见变异的假定功能和作用需要进一步研究[46]。这些发现使得人们对于配子融合的分子机制有了更进一步的认识。
2016年《Nature》同期发表了两篇文章[37, 39]，解析了人卵子上Juno和精子上Izumo1受精复合物的分子结构，形象地揭示了哺乳动物受精过程中精卵结合的过程。Izumo1显示了一个由螺旋束Izumo结构域和一个IG样结构域组成的细长杆状结构，这2个结构域通过4个保守的二硫化物键固定在中间的β-发夹区域[39, 47]。另一方面，Juno有一个球形结构，由8个二硫化物键稳定。Izumo1-Juno复合体以1:1的比例相互作用。夹在Izumo1和IG域之间的Izumo1 β-发夹区域提供了Juno结合的主要平台。通过对Izumo1-Juno复合体结构的研究，发现了其识别的关键氨基酸残基。Ohto等[39]利用氨基酸替代突变的Izumo1小鼠的COS-7细胞，通过细胞-卵母细胞试验，证实Izumo1-Juno相互作用的生物学重要性。结果表明，Izumo1的W148、H157和R160以及Juno的W52和L81对精子和卵细胞质膜的识别至关重要。
在受精过程中，成熟的精子通过顶体反应经透明带区域到达卵周间隙内。顶体反应同时导致了Izumo1重新定位到精子的赤道部分[48-49]。Izumo1在精子膜表面呈现单体回旋镖的构象。一旦和卵子的Juno蛋白受体结合，Izumo1就会发生构象变化(图 1)。同时，Izumo1的铰链区变得更加坚硬，并牢牢锁在保持直立的位置。Izumo1和Juno的复合物给精子和卵子的质膜提供了直接的物理连接[39]。现在还不清楚Izumo1是否需要利用与Juno的结合来触发精卵融合的步骤，但是触发精卵融合至少有3种可能的发生机制：1)Izumo1和Juno复合物进行异型装配，或Izumo1发生二级构象变化，可使卵细胞和精子膜接近，以便进行融合。2)在Izumo1-Juno结合之后，蛋白质二硫化物异构酶(PDI)催化巯基-二硫化物交换反应，从而导致Izumo1的结构构象变化和二聚化。Izumo1二聚体释放Juno并与一种促进膜融合的卵母细胞受体接触，从而导致融合[50-51]。3)或者，Izumo1可以作为一种支架，以类似于某些病毒融合原的方式招募其他精子或卵子的蛋白伴侣形成多蛋白融合复合物，从而触发融合。卵细胞膜和精子膜的融合将需要2个双分子层膜并排放置在一起，然后外膜小叶发生初始混合，并形成半融合茎。然后半融合的双分子膜开放，形成完全融合的融合小孔通道。融合后，Juno迅速从受精卵细胞分泌到细胞外囊泡。30~40 min后，在有完整卵细胞透明带的受精卵或无透明带分裂二期受精卵的膜表面就几乎无法检测到Juno，同时在原核阶段也无法检测到[2]。Izumo1与Juno的结合紧密而迅速。一旦Juno脱落就能够在卵周隙空间内找到进入的精子，并与精子上暴露的Izumo1结合，作为“精子沉淀剂”来阻断多精入卵[37](图 1)。
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1.精子与卵子相遇；2.顶体反应；3.精子经透明带到达卵周间隙内；4.精子表面的Izumo1蛋白与卵子质膜表面Juno蛋白相遇；5. Izumo1蛋白发生构像变化并与Juno蛋白结合，之后可能与其他蛋白结合，触发精卵融合；6.精卵融合发生后，卵子质膜上的Juno蛋白脱落，并与进入卵周间隙的其他精子表面上的Izumo1蛋白结合，阻止多精入卵的发生 1. Sperm-egg encounter; 2. Acrosome reaction; 3. Sperm reaching the peri-egg space through zona pellucida; 4. Izumo1 protein on sperm surface meets Juno protein on the egg plasma membrane; 5. The conformation of Izumo1 protein changes and binds to Juno protein, which may then bind to other proteins to trigger sperm-egg fusion; 6. After sperm-egg fusion occurs, Juno on the plasma membrane of the egg falls off and binds to Izumo1 protein on the surface of other sperm entering the peri-egg space to prevent polyspermy 图 1 精卵融合过程中Izumo1与Juno的识别与互作 Fig. 1 Recognition and interaction of Izumo1 and Juno in sperm-egg fusion |
迄今为止，虽然已经证实Izumo1-Juno的结合启动了精卵质膜的融合，但从最初精卵的结合到质膜融合转变的具体分子机制尚不清楚。Ohto等[39]提供证据表明，Izumo1中的二硫键很容易被破坏，或许在和Juno结合后，Izumo1可能暴露出二硫键以进行交换。验证这一假设，确定Izumo1-Juno结合如何触发膜融合，需要鉴定出Juno脱落后与Izumo1结合的蛋白质，并探究精卵开始识别后发生的事件[52]。
6 其他影响精卵融合的蛋白由于膜融合从未发生在仅表达Izumo1的COS-7细胞中，精卵融合可能有多个步骤[14, 50, 53]。靶向缺失研究也表明，除Izumo1和Juno外，卵母细胞上的CD9和精子上的SPACA6是精子融合所必需的两种蛋白[19-21, 54]。同时也发现，CD9/CD81双敲除雌性小鼠完全不育[55]。Agopiantz等[56]选择了5种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(Cpm、Ephrin-A4、Gas1、Gfra1和Rgmb)作为参与受精的潜在卵母细胞候选蛋白。Western blot、免疫荧光分析和卵母细胞的受精能力分析试验显示，小鼠中有2个候选蛋白明显参与了受精过程，即生长停滞特异性1蛋白(Gas1)和胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α1(Gfrα1)。Gfrα1是一种细胞自我更新的分子标记[57]。Gas1是一种多效性蛋白，可以诱导细胞增殖、细胞停滞和凋亡。Gas1在肿瘤的发生中具有重要作用[58-60]。
最近的研究表明，一种新的精子蛋白，即杀菌/通透性增强蛋白(BPI)，也参与了精子卵母细胞融合过程[61]。新的具有隐性突变的小鼠系BART97b表现出受精阻滞，并与精子融合失败相关。Lorenzetti等[54]发现，BART97b小鼠突变体携带一个使Spaca6失活的缺失突变，Spaca6是一个以前未被标记的在睾丸中表达的基因。与Izumo1相似，Spaca6编码免疫球蛋白样蛋白。Spaca6基因产物可能与Izumo1结合，通过结合一个尚未确认的卵膜受体来介导精子融合。Ito等[62]建立了一个小鼠突变体，即Equatorin敲除(Eqtn-KO，Eqtn-/-)小鼠模型，发现Eqtn-KO雄性小鼠的生育能力和精卵黏附力降低，而Eqtn-KO雌性小鼠具有生育能力。Eqtn-/-型精子的形态和运动正常。但与野生型雌性交配的Eqtn-/-雄性小鼠在生育能力以及附着在无透明带卵母细胞上的精子数量均显著降低。在Eqtn-/-型精子与野生型卵细胞受精后，精子Izumo1和卵细胞的CD9均表现正常。而在Eqtn-/-型精子中，另一个顶体蛋白Spesp1在顶体反应过程中表现异常。缺乏Eqtn和Spesp1 (Eqtn/Spesp1-/-)的Eqtn/Spesp1双敲除雄性小鼠比Eqtn-/-单敲除小鼠的繁殖损失更严重。
7 结语与展望在所有生命体的配子识别过程中，Izumo1和Juno是目前发现的第一个精子和卵子质膜上的配体-受体蛋白对。这两种蛋白在精卵融合过程中有着举足轻重的地位。Izumo1-Juno识别系统已被X射线结晶学破译。二聚体Izumo1在Izumo1-Juno识别后，可能还会特异识别卵子表面未知的第二受体。精卵融合是一个多分子参与的事件，可能还有许多其他分子参与其中。至于这些分子间是如何相互作用来精确调控精卵融合过程的还不明晰，需要进一步深入研究。同时，这也是近年来的研究热点。鉴定出参与融合过程的所有分子将对精卵融合机制的阐明大有裨益。Izumo1和Juno的生物学功能也预示着它将成为未来哺乳动物遗传学与繁殖学的研究重点之一，具有重大的科学意义。相信在生物技术高速发展的大背景下，哺乳动物受精过程之谜终会被解开。明确受精的分子机制将有助于临床治疗不孕症，并支持未来新避孕策略的潜在发展。
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