精浆中的肉碱是精液的重要成分之一，它在精子的运动中起着重要的作用。肉碱是一种两性离子化合物(三甲基氨基-羟基丁酸的甜菜碱)。它的作用是从细胞质中运载长链脂肪酸到线粒体基质后进行氧化。肉碱主要由肝细胞产生，它在血液中浓缩，并由包皮和附睾上皮分泌到附睾腔内[1]。肉碱在精子通过附睾时被精子部分吸收，它的浓度与精子数和精子活力密切相关[2-5]。睾丸中生成的精子并不具备运动和受精能力，它在附睾中成熟并且获得运动能力，而精浆中的肉碱含量是评定附睾功能的重要标志，因此精浆肉碱作为精子成熟的重要成分对精子的获能起到重要作用。
目前，对于精液品质的研究主要集中在生化指标及肉碱等物质对精液品质影响方面[6-8]，孙鹏[9]通过对62例不孕不育患者服用精加力复合肉碱进行研究, 经过2~3个疗程后统计发现，服用精加力复合肉碱组患者的精子活率、精子活力、精子DNA碎片化指数(DFI)、胚胎种植率、临床妊娠率均显著高于未服用组患者(P＜0.05)。李克等[10]研究精浆中游离L-肉碱水平与α-葡糖苷酶、果糖以及酸性磷酸酶3项副性腺生化指标之间的相关性时发现，正常生育组精浆中游离肉碱水平明显高于不育组(P＜0.01), 精浆中游离L-肉碱水平与精浆中α-葡糖苷酶活性具有较强的正相关关系(r=0.504, P＜0.001)；因此，测定精浆中游离L-肉碱的水平可作为评估男性附睾功能的一项生化指标。目前人们对于精浆肉碱与精子活力的关系研究大多运用常规的试验方法，使用液质联用技术对精浆肉碱的研究很少；由于液相色谱与质谱联用检测生物样本有分离能力高、灵敏度好和特异性强的优点[11-13]，已被大量应用于包括奶牛疾病诊断和生理机能研究在内的多个领域[14-15]，但是在有关精浆肉碱与精子活力方面的研究并不多，因此，使用LC-MS技术研究精浆肉碱与精子活力的关系具有重要意义。
在肉用种公牛精液生产中，常常出现精液活力差的个体，研究其发生机理对解决或预防这种情况的发生，提升精液品质有重要意义。本试验运用UPLC-Q-TOF MS和UPLC-Q-Trap MS检测技术，结合单变量统计分析方法研究肉牛精子活力与精浆肉碱的变化关系，为研究肉牛精液品质变化机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 仪器质谱:Triple TOF 5600+质谱仪(AB SCIEX), 色谱:Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent), 色谱柱:Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column；超高效液相色谱系统(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A, https://www.shimadzu.com/), QTRAPⓇ6500+串联质谱仪(AB SCIEX), 色谱柱：Thermo C30柱(i.d.2.1×100 mm 2.6 um)。
1.2 样品采集与分组样品采集严格按照中华人民共和国实验动物保护与利用相关规定，所有的操作均由宁夏大学动物保护协会批准。试验精液样品均采集于甘肃省家畜繁育中心年龄为(4.9±0.8)岁的26头西门塔尔种公牛，每头种公牛1周采精2次，每次采集两遍，间隔时间为30 min，采精时间为2018年4月。精液采集后应用相差显微镜成像法，目测精液活力，并使用密度仪检测精液密度，并测定采精量。以所检测样品的精子活力为标准进行分组，精子活力大于0.65的为正常组(对照组，用N表示)，一共包括14份生物学样品。精子活力小于0.65的为异常组(试验组，用Ab表示)，一共包含12份生物学样品。在4 ℃下3 000 r·min-1下离心10 min取上清液，置于－80 ℃保存，用于后续分析。
1.3 样品预处理 1.3.1 UPLC-Q-TOF MS检测样品预处理分别取每例样品100 μL，将400 μL甲醇/乙腈(2:2，v/v)分别被加入到每例样品后进行涡旋混匀，然后在低温下进行2次超声破碎，每次持续时间为30 min，紧接着在－20 ℃孵育沉淀蛋白质，时间为1 h。4 ℃、13 000 r·min-1离心15 min，取上清液进行冻干后置于－80 ℃备用。进行质谱分析时，加入100 μL乙腈水溶液(乙腈:水=1:1，v/v)后进行复溶，涡旋震荡后再次在14 000 g，4 ℃离心15 min，上清液被用于进样分析。同时，为了平衡色谱-质谱系统及测定仪器状态，客观评价整个试验过程中系统的稳定性，预处理完成后，再制备4个质控样本(quality control，QC)，即取不同、等量的试验样品上清液混合而成；在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。
1.3.2 UPLC-Q-Trap MS检测样品预处理从－80 ℃冰箱中取出样品, 放在装有冰的离心管盒里解冻，待样本完全解冻后，涡旋混匀10 s左右。4 ℃、3 000 r·min-1离心5 min；取样本50 μL加入到对应的已编号的离心管中，加入1 mL甲醇：MTBE提取液(含内标混合液)；涡旋2 min，超声5 min，加入500 μL水；涡旋1 min, 12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，离心完成后吸取上清液500 μL到已编号的离心管中，浓缩；用100 μL流动相B复溶，用于LC-MS/MS分析。
1.4 两种液质检测技术对样品的测定 1.4.1 UPLC-Q-TOF MS检测整个分析过程样品始终置于4 ℃的自动进样器中，然后利用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统的HILIC色谱柱将样品进行分离。进样量为2 μL，柱温设为25 ℃，流速设为0.3 mL·min-1；色谱流动相A：水+25 mmol·L-1乙酸铵+25 mmol·L-1氨水，B:乙腈；色谱梯度洗脱程序见表 1。在分析过程中，样本队列中插入QC样品用来监测和评判系统的稳定性和试验数据的可靠性。然后使用电喷雾电离方法对每例样品进行正、负离子模式检测。等样品经过UPLC方法分离后，进一步采用Triple-TOF 5600质谱仪进行质谱分析。
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表 1 UPLC-Q-TOF MS梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of UPLC-Q-TOF MS |
此次数据采集在超高效液相色谱系统(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A, https://www.shimadzu.com/)Thermo C30色谱柱下进行分离，进样量为2 μL，此时柱温为45 ℃，流速为0.35 mL·min-1；色谱流动相A为乙睛/水(60/40，含0.04%乙酸，5 mmol·L-1甲酸铵)；B相为乙睛/异丙醇(10/90，含0.04%乙酸，5 mmol·L-1甲酸铵)；色谱梯度洗脱程序见表 2。同样制备QC样品和使用电喷雾电离。样品经过串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)(QTRAPⓇ6500+，https://sciex.com/)进行质谱分析，质谱条件下，电喷雾离子源温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气(curtain gas, CUR)35 psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation, CAD)参数设置为中。在三重四极杆(Qtrap)中，根据优化的去簇电压和碰撞能对每个离子对进行扫描检测分析验证。
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表 2 UPLC-Q-Trap MS梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program of UPLC-Q-Trap MS |
通过ProteoWizard将所有原始数据转换成.mzXML格式，进一步采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和峰面积提取。删除组内缺失值超过50%的离子峰。然后采用SIMCA-P14.1软件对离子峰进行多维统计分析，主要包括无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。使用PCA和OPLS-DA模型反映两组精浆样品代谢轮廓的变化，通过OPLS-DA模型算出相应的变量投影重要度(VIP)。最后使用Originpro8.0软件对VIP>1的代谢物进行差异性分析，分析结果用P值表示，P < 0.05表示差异显著。
1.6 差异代谢物的鉴定UPLC-Q-TOF MS检测结果统计分析差异代谢物的鉴定采用精确质量数匹配(< 25 ppm)与二级谱图匹配相结合的方法进行代谢物结构分析，检索对比在线数据库HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)和METLIN (http://metlin.scripps.edu/)；然后利用牛代谢组学数据库(DMDB, http://www.cowmetdb.ca/)进行比对和校正。应用UPLC-Q-Trap MS检测的差异代谢物的鉴定MWDB代谢数据库对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。
2 结果 2.1 牛精液样品品质检测结果测定数据经Excel初步整理后，使用SPSS 22.0对数据进行方差分析，最终测得的结果用“平均值±标准差”表示。当差异显著时，用LSD法做多重比较。显著性水平为P＜0.05。由表 3分析结果可知，正常组精子活力极显著高于异常组(P < 0.01)，密度和采精量均表现为差异不显著。
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表 3 异常组与正常组精液样品品质检测结果 Table 3 Semen quality test results of Abnormal and Normal group |
将QC样本在正、负离子检测模式下的质谱总离子流图(TIC)分别进行谱图叠加比较(图略)，结果表明，两种检测方法TIC峰形状完整，各色谱峰的响应强度和保留时间都基本重叠，相邻峰之间分离明显，说明在整个试验过程中仪器误差带来的变异很小，测得的数据质量可靠。异常组与正常组精液样品多元统计分析结果见表 4。
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表 4 异常组与正常组精液样品多元统计分析结果 Table 4 Results of multivariate statistical analysis of semen samples in the abnormal and normal groups |
UPLC-Q-TOF MS和UPLC-Q-Trap MS检测结果中差异代谢物以VIP >1、P < 0.05和FC ≥ 1.5或FC ≤ 0.67为筛选标准，其中FC为异常组与正常组平均数的比值。在UPLC-Q-TOF MS和UPLC-Q-Trap MS检测中共筛选出9种肉碱类物质(表 5)，分别是L-氯化棕榈酰肉碱、L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱、游离肉碱、乙酰肉碱、羟丁基-肉碱、3-羟基辛基肉碱、肉毒杆菌-肉碱和己烯基肉碱。两次筛选的肉碱类物质的FC值均大于1，说明这几种肉碱均表现为上调模式，即异常组中肉碱含量均高于正常组。
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表 5 UPLC-Q-TOF MS和UPLC-Q-Trap MS检测技术筛选出的肉碱类物质 Table 5 Carnitine compounds screened by UPLC-Q-TOF MS and UPLC-Q-Trap MS detection technologies |
精子在睾丸中生成后并不具备运动和受精能力，它需要在附睾中经过一段时间的储存后才会变得成熟并具有运动能力，在射精时与精囊腺、前列腺和附睾分泌的物质一起排出[16]。精浆中肉碱的含量是评定附睾功能的标志。附睾中存在高浓度的肉碱和乙酰肉碱，附睾的精子中富含肉碱酰基转移酶[17]。当线粒体在进行长链脂肪酸的β氧化时，肉碱扮演一个重要的角色，它不但能够促进脂肪酸的转运和氧化，而且还参与线粒体的能量代谢[18]。脂肪酸β氧化时主要的催化对象是含14~18个碳的碳链的脂酰基辅酶A脱氢，每经过一轮循环，产生一个乙酰辅酶A，主链就会减少2个碳原子[19]。在本研究筛选出的9种肉碱类物质中，异常组中L-氯化棕榈酰肉碱、L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱长链脂酰肉碱含量均高于正常组，它们经过多次脂肪酸β氧化后，碳原子不断减少，使得中短链脂酰肉碱如3-羟基辛基肉碱(中链)、己烯基肉碱、羟丁基-肉碱、乙酰肉碱增多。因此，肉碱是精子运动和获能必不可少的载体物质。肉碱浓度下降将会导致线粒体内β氧化途径受阻，不能为精子提供足够的能量，导致精子的活力降低[20]。之前有研究表明，男性精浆中游离肉碱和总肉碱的含量与精子浓度[21]、数量[22]、活力[23-24]和正常形态精子的百分比[4]呈正相关关系，即精浆中游离肉碱和总肉碱含量越多，精子浓度和活力就越高，这说明精浆中游离肉碱和总肉碱的含量与精子的发生过程密切相关。本研究先后使用两种LC-MS检测技术分析验证了西门塔尔种公牛精子活力与精浆肉碱的关系，两次试验结果均表明，精子活力异常组中肉碱类物质的含量都显著高于精子活力正常组。本研究结果与对人的试验结果相反，这可能是由于物种之间的差异性造成的，不同物种中的肉碱在附睾中的表达模式不同，从而引起的效果不同。也有人在研究男性精浆中的肉碱含量与精液参数的关系时发现，精浆肉碱含量与精子正常形态百分率呈负相关的趋势[18]。也就是说，精浆中肉碱含量越多，精子正常形态百分率越低，从而引起精子活力下降。但在本研究中没有对精子正常形态百分率进行统计。至于精浆肉碱含量是否影响精子正常形态百分率，进而影响其活力，还需进一步验证。
目前已有临床试验证实，外源性的补充肉碱能够改善男性精液品质[25-28]。因为精子在附睾中停留两周左右才变得成熟，补充肉碱等物质可以辅助精子在此期间获得运动能力。有人通过连续两周每天早、中、晚各服用10 mL左旋肉碱的方法对42例患有少弱精子症的患者在卵细胞胞质内进行单精子注射治疗，服用前(a+b)级精子的百分率为(9.6±7.2)%，服用左旋肉碱两周后(a+b)级精子百分率为(13.5±10.7)%，显著高于服用前(P＜0.05)；与87例未服用肉碱的少弱精子症的患者相比，服用左旋肉碱组卵细胞胞质内单精子注射技术操作后有效胚胎率(77.50%)显著高于未服用肉碱组(69.04%，P＜0.05)。因此短期服用左旋肉碱可以改善男性精子质量，并有助于提高少弱精子症患者治疗不育的成功率[29]。牛玉森[30]对9篇关于左旋肉碱治疗效果的国内外文献进行了Meta分析，结果显示，使用左旋肉碱的治疗组精子浓度、活率、妊娠率和精子前向运动率都比不使用左旋肉碱的对照组高。卢彦欣等[31]研究发现，持续25 d使用100 mg·kg-1的左旋肉碱可以提高少弱精子症小鼠的精子密度，在一定程度上能够提升精子活率及降低精子畸形率，对睾丸损伤有一定的保护作用。单妹等[32]研究发现，在种公猪的基础日粮中每吨添加300 g 50%的左旋肉碱和维生素，饲喂45 d后，公猪的精子活力和精子密度显著提高，精子畸形率显著下降。以上结果均表明，外源性补充肉碱对精子质量有明显的改善治疗作用，也就是说，高含量的肉碱有益于雄性精液品质的提高。但就本研究在西门塔尔种公牛精液的研究中发现精子活力低的精浆中肉碱水平反而高。
4 结论本试验先后使用高分辨率和高灵敏度的两种液质联用技术对西门塔尔种公牛精浆中的肉碱类物质进行分析验证，发现了9种肉碱类物质在精子活力异常组的精浆中显著高于正常组。这为研究牛精浆中肉碱浓度对精液品质的影响提供了新的方法和思路。
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