2. 扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室, 扬州 225009
2. Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
仔猪腹泻是许多规模化养猪场最为常见的一类疾病,对养猪生产造成了严重的经济损失[1],其中F18大肠杆菌(E. coli F18)是目前规模化养猪场仔猪细菌性腹泻最普遍、致病性较强的病原之一[2]。F18大肠杆菌致病机理已经相对清楚,主要通过菌毛特异性的吸附小肠上皮细胞表面相应的受体,从而定居,大量繁殖,产生的肠毒素进入小肠细胞内引起一系列免疫反应和病理效应,进而刺激肠上皮细胞分泌大量液体进入肠腔,引起仔猪腹泻。因此,仔猪抵抗F18大肠杆菌感染,关键在于小肠上皮细胞F18大肠杆菌受体表达与否以及机体肠道固有免疫能力的差异。目前,研究发现,α(1, 2)岩藻糖转移酶(alpha (l, 2) fucosyltransferase)基因1(FUT1)是控制F18菌毛与小肠黏膜受体结合的重要候选基因,其中编码区M307位点G/A突变(丙氨酸→苏氨酸)作为猪抵抗F18大肠杆菌的一个遗传标记[3-4],该标记在国外猪品种(如杜洛克猪)已经成功实现抗病育种(申请专利号:443766)。然而,FUT1基因标记在20多个中国国内地方猪品种中呈现极端偏态分布[5-9],由此表明,适用于引进猪种的FUT1基因标记并不适用于中国地方猪品种的抗病育种。本课题组前期以中国地方品种梅山猪断奶仔猪为研究对象,利用F18菌株感染及一系列验证试验获得了确证的梅山猪F18大肠杆菌抗性与敏感型断奶仔猪个体[10],通过十二指肠转录组测序分析筛选出F18大肠杆菌抗性相关的重要调控通路(TLRs信号通路)及CD14等关键基因,没有发现岩藻糖转移酶基因如FUT1及其所在的通路发挥重要的调控作用[11]。由此进一步推测,中外猪品种抵抗F18大肠杆菌感染的遗传基础和调控机制存在一定的差异。本课题组前期建立了含有国内地方和外来血统的培育品种—苏太猪(杜洛克×梅山猪)F18大肠杆菌抗性型和敏感型家系群体,运用细菌与小肠上皮细胞体外黏附试验严格鉴定并筛选出了苏太猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型的全同胞个体[12-13],并且利用该样本在细胞水平和个体水平上进行了F18大肠杆菌抗性相关候选基因或蛋白质的功能验证[14-20]。
为了系统揭示苏太猪F18大肠杆菌抗性调控的遗传基础和分子机制,本研究对苏太猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠进行转录组测序,通过生物信息学方法重点筛选重要调控通路和候选基因,利用qPCR验证重要候选基因分别在梅山猪和苏太猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠组织中的差异表达情况,同时,在细胞水平上利用F18大肠杆菌菌体(F18ab、F18ac)分别刺激猪小肠上皮细胞系IPEC-J2,利用qPCR和Western blot检测重要候选基因和蛋白的表达变化,继续探讨苏太猪和梅山猪在抵抗F18大肠杆菌感染过程中分子机制的差异,为进一步阐明国内外猪品种对F18大肠杆菌抗性的遗传基础及其差异提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 样本来源苏太猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型断奶仔猪来自于课题组前期建立的苏太猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型资源家系群体,前期已经通过V型分泌系统展呈功能性黏附素和受体结合试验技术严格筛选出E. coli F18抗性型与敏感型全同胞配对个体各3头[12-13],用于本试验的转录组测序分析以及组织表达分析;此外,课题组前期采用F18ab和F18ac菌株口服攻毒试验,并利用仔猪肠道E. coli F18细菌检测、细菌计数以及小肠上皮细胞黏附试验获得了确证的梅山断奶仔猪E. coli F18抗性型与敏感型个体[10],各选取3头用于本试验的组织表达分析;苏太和梅山E. coli F18抗性型与敏感型断奶仔猪屠宰后,取十二指肠组织置于1.5 mL无酶管中,现场液氮保存,然后转移至-80 ℃冰箱保存备用。小肠上皮细胞系IPEC-J2由美国宾夕法尼亚大学惠赠。
1.2 试验材料与试剂猪小肠上皮细胞系IPEC-J2、大肠杆菌F18ab、F18ac菌株均由美国宾夕法尼亚大学所赠;胎牛血清FBS、培养液DMEM/F12、胰酶Trypsin-EDTA Solution、细胞培养孔板均购自Gibco公司(美国);RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司(美国);反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(中国,南京);总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒购自南京凯源科技发展有限公司(中国,南京); 一抗TLR5 (1:800)、FUT2 (1:600)、IL-1β (1:600)购自Abcam(Cambridge,UK);二抗(IgG-HRP,1:3 000)购自Jackson(PA,USA); 切胶回收试剂盒、无内毒素质粒抽提试剂盒购自天根生物技术有限公司(中国,北京)。
1.3 RNA提取、cDNA文库建立以及上机测序使用Trizol法对样品进行总RNA的抽提。进行RNA样品质量检测,包括首先利用Nanodrop检测RNA的浓度和纯度(OD260 nm/OD280 nm),然后通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳来检测RNA是否有降解或污染,最后利用Qubit和Agilent2100分别对RNA浓度和完整性进行精确检测。在此基础上,通过Oligo dT富集、cDNA合成、末端修复加接头和PCR扩增来进行cDNA文库建立,最后利用Hiseq4000上机测序,数据量为6G clean data/样本。
1.4 生物信息学分析 1.4.1 差异表达基因分析根据Fold change(差异倍数)和P-value(显著水平)两个指标对差异表达基因进行筛选,阈值设定一般为log2(Fold change)>1且P-value < 0.005。不同分组间差异表达基因的整体分布情况可以用火山图来表示,所用分析软件为DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)。
1.4.2 差异表达基因的功能富集与注释利用GOSeq[21]软件挖掘差异表达mRNA的主要生物学功能,包括分子功能(molecular function)、细胞组成(cellular component)、生物学过程(biological process);利用KOBAS[22]软件分析差异表达mRNA的代谢通路注释(KEGG Pathway)。
1.5 F18大肠杆菌刺激猪小肠上皮细胞IPEC-J2将大肠杆菌F18ab、F18ac菌株分别接种于LB培养液,200 r·min-1摇菌12 h,3 000 r·min-1离心10 min,收集菌体,用PBS缓冲液洗涤菌体,沉淀并离心,反复操作3次。菌体最后用细胞培养液稀释至1.0×109 CFU·mL-1,按每孔1 mL的量加入细胞培养孔,每组有3个平行样,4 h后收集细胞,菌体刺激的IPEC-J2细胞作为试验组,未作处理的IPEC-J2细胞作为对照组。
1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测根据GenBank数据库已公布的猪FUT2、IL-1β和TLR5基因序列,利用Primer5.0软件设计Real-time PCR引物(表 1),以GAPDH和β-actin为内参基因,所设计引物均跨外显子,以避免PCR产物中有DNA污染,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
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表 1 荧光定量PCR所用引物信息 Table 1 Primer informations for real-time PCR |
根据反转录试剂盒说明书进行操作,以RNA为模板进行cDNA合成:反应体系中含2 μL 5 × qRT SuperMix Ⅱ,500 ng总RNA,无酶水补足至10 μL。反应程序:25 ℃ 10 min,50 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。Real-time PCR反应体系为25 μL:SYBR Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL,PCR上下游定量引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×),2 μL cDNA,ddH2O 9 μL。每个样本设置3个重复。扩增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s,40个循环;利用扩增曲线和熔解曲线分析扩增效果及引物的特异性,具体程序:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。
1.7 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测以F18菌体刺激前后的猪小肠上皮细胞IPEC-J2为样本,使用全蛋白抽提试剂盒提取细胞和组织总蛋白,并通过BCA试剂盒检测蛋白含量,使蛋白质水平标准化。SDS-PAGE(10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳):取10 μL蛋白质上样,160 V跑胶70 min。Western blot(蛋白印迹):蛋白质转移到PVDF(聚丙烯二氟乙烯)膜上,与相关抗体进行免疫印迹,TLR5 (1:800)、FUT2 (1:600)、IL-1β (1:600)抗体作为一抗,兔原抗体IgG(Abcam, UK, 1:5 000)作为二抗,β-actin (1:4 000)作为参照。
1.8 数据统计分析对内参基因GAPDH和β-actin的Ct值取几何平均数,并采用2-ΔΔCt法[23]处理相对定量的结果,用内参基因对表达水平进行均一化。利用SPSS 16.0软件的一般线性模型(general linear model, GLM)对基因和蛋白在菌体刺激细胞前后、抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的表达差异情况进行比较分析。
2 结果 2.1 苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体十二指肠转录组分析3头苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型(SR1、SR2、SR3)个体与3头敏感型个体(SS1、SS2、SS3)十二指肠组织样本和测序数据均经过严格的质量检测后,RNA总量、完整性以及纯度均符合测序标准(RIN≥6.5;OD260 nm/OD280 nm≥1.8;28S/18S≥1.0),本研究运用RNA-seq技术获得苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠的转录本,3头抗性型(SR1、SR2、SR3)与3头敏感型(SS1、SS2、SS3)个体分别获得1 324 600、1 405 100、1 321 800、1 464 900、1 371 900、1 266 400条raw reads,比对到猪参考基因组(Sscrofa10.2)上,81.2%~82.7%的reads匹配到参考基因组上,其中68.5%~71.8%属于特异性匹配;为了进一步探究苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体十二指肠的差异表达转录本,利用经随机方差模型修正后的T-检验(RVM-T test)计算测序所检测到的基因表达的显著性水平(P-value),筛选出两组间差异表达mRNA共238个,其中抗性组上调差异表达基因(differential expression genes, DEGs)112个,下调DEGs 126个(部分DEGs见表 2)。
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表 2 苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体十二指肠部分差异表达基因 Table 2 Partial differential expression genes in duodenum of Sutai E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive weaned piglets |
差异表达基因的功能注释结果表明,大部分基因主要显著参与14种GO分类,其中涉及到免疫系统过程(immune system process)、免疫应答(immune response)、海藻糖酶活性(trehalase activity)等,具体见表 3;筛选的差异表达基因主要显著参与20个pathway通路,其中涉及到免疫相关通路如Toll样受体信号通路(toll-like receptor signaling pathway)(包括TLR5、IL-1β基因)和糖脂类通路(glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series)(包括FUT2基因),见表 4。
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表 3 苏太断奶仔猪十二指肠差异表达基因的GO功能富集分析 Table 3 Gene ontology (GO) enrichment analysis of differentially expressed genes in duodenum of Sutai weaned piglets |
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表 4 苏太断奶仔猪十二指肠差异表达基因的KEGG通路富集分析 Table 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes in duodenum of Sutai weaned piglets |
基于转录组测序和功能注释分析,本研究筛选出大肠杆菌F18受体形成相关基因FUT2[29],以及免疫调控相关基因IL-1β和TLR5[28]。为了进一步探究这3个重要候选基因(FUT2、IL-1β和TLR5)表达水平与F18大肠杆菌感染的关系,分别通过F18ab、F18ac菌体刺激小肠上皮细胞IPEC-J2,并利用qPCR和Western blot检测FUT2、IL-1β和TLR5表达变化。结果显示(图 1),F18ab和F18ac菌体刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后,3个基因均表现出显著的上调表达(P < 0.05),进一步的Western blot验证结果和qPCR相一致(图 2)。
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Control表示对照组;F18ab表示F18ab菌体刺激IPEC-J2;F18ac表示F18ac菌体刺激IPEC-J2。*. P < 0.05 Control represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation. *. P < 0.05 图 1 F18大肠杆菌刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后重要差异表达基因的qPCR验证 Figure 1 qPCR validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation |
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NC表示对照组;F18ab表示F18ab菌体刺激IPEC-J2;F18ac表示F18ac菌体刺激IPEC-J2 NC represents the control group; F18ab represents the IPEC-J2 after F18ab-stimulation; F18ac represents the IPEC-J2 after F18ac-stimulation 图 2 F18大肠杆菌刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后重要差异表达基因的Western blot验证 Figure 2 Western blot validation of important DEGs in IPEC-J2 cells after E.coli F18 stimulation |
为了进一步验证转录组筛选出来的重要差异表达基因(FUT2、IL-1β和TLR5),本研究在课题组前期获得的梅山猪和苏太猪断奶仔猪F18抗性型与敏感型个体十二指肠组织中进行qPCR验证,结果显示,TLR5基因在苏太猪抗性组十二指肠组织中表达水平极显著高于敏感组(P < 0.01),IL-1β显著高于敏感组(P < 0.05),而FUT2在敏感组中极显著高于抗性组(P < 0.01)(图 3);TLR5、IL-1β基因在梅山猪抗性组十二指肠组织中表达水平均极显著高于敏感组(P < 0.01),而FUT2在梅山猪抗性组和敏感组中表达水平无显著差异(P>0.05)(图 4)。
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SR表示苏太猪F18抗性组;SS表示苏太猪F18敏感组。*. P < 0.05,**. P < 0.01,下同 SR represents the Sutai E. coli F18-resistant group; SS represents the Sutai E. coli F18-sensitive group; *. P < 0.05; **. P < 0.01, the same as below 图 3 重要候选基因在苏太猪F18抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的差异表达分析 Figure 3 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Sutai E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals |
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MR表示梅山猪F18抗性组;MS表示梅山猪F18敏感组 MR represents the Meishan E. coli F18-resistant group; MS represents the Meishan E. coli F18-sensitive group 图 4 重要候选基因在梅山猪F18抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的差异表达分析 Figure 4 Differential expression analysis of important candidate genes in duodenal tissues between Meishan E. coli F18-resistant and E. coli F18-sensitive individuals |
仔猪抵抗F18大肠杆菌感染,关键在于小肠上皮细胞F18大肠杆菌受体表达与否以及机体肠道免疫调控能力的差异[16]。Coddens等[24]通过对不同日龄的74头长白猪进行检测发现,随着日龄的增加,E. coli F18受体的表达水平呈上升趋势,尤其是在0~3周龄逐渐升高,而在3~23周龄维持平衡状态。未断奶的仔猪对大肠杆菌不敏感,不仅是因为大肠杆菌受体尚未形成,也由于母源抗体能够保护仔猪免受致病菌感染[25]。因此,本研究选择35日龄断奶仔猪,这一时期无论表型还是自身的免疫机制,都表现出最易感染F18大肠杆菌。
基于课题组前期对梅山猪F18大肠杆菌抗性相关基因及其调控通路的研究[11],本研究严格选择苏太猪F18大肠杆菌抗性型和敏感型断奶个体进行转录组测序,筛选出2个重要调控通路:Toll样受体信号通路(KO. 04620)和鞘糖脂合成通路(KO. 00601),以及重要差异表达基因(TLR5、IL-1β、FUT2)。TLR5、IL-1β均属于Toll样受体(TLR)家族基因,Toll样受体(TLR)家族能够识别保守的微生物结构(如细菌脂多糖)并激活信号通路,从而导致由微生物感染引起的免疫应答[26]。TLR能够感应肠道中的微生物群体,并启动促炎信号通路来抵抗微生物病原体的入侵,研究表明,TLRs在机体激活固有免疫和诱导适应性免疫的防御机制,特别是在先天性固有免疫中起着重要作用[27]。TLRs家族中,TLR5是机体识别革兰氏阴性菌鞭毛蛋白的受体,鞭毛蛋白是革兰氏菌鞭毛的主要成分,它可以直接被体内T细胞和B细胞识别,TLR5与鞭毛蛋白结合后,将进一步激活核转录因子NF-κB,而刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症细胞因子的产生,从而介导机体针对病原菌的先天性免疫及炎症反应[28]。大肠杆菌F18受体最小抗原决定簇是ABH血型抗原中的1型H抗原[29-31],由α-(1, 2)岩藻糖基转移酶基因(FUT1、FUT2)催化的1型H-抗原被称为组织血型抗原,它主要分布在分泌液,起源于组织的外胚层和中胚层中,而不是在红细胞膜表面[31-33]。基于以上研究报道,本研究发现,一方面通过F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后,FUT2、TLR5、IL-1β的表达均显著上调,另一方面对其在抗性型与敏感型个体肠道组织中表达水平进行检测,发现FUT2在敏感组中极显著高于抗性组(P < 0.01),而TLR5、IL-1β基因在抗性组中表达水平均显著高于敏感组(P < 0.05),综合两者结果,在细胞水平和个体水平上验证表明,TLR5、IL-1β、FUT2基因表达水平与F18大肠杆菌感染有关。
研究发现,Toll样受体信号通路及其CD14基因在梅山断奶仔猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中起免疫调控作用[11],本研究利用转录组测序结合功能验证分析发现,Toll样受体信号通路及其TLR5和IL-1β基因、鞘糖脂合成通路及其FUT2基因表达水平与苏太猪F18大肠杆菌抗性有关。此外,研究发现,FUT1是控制F18菌毛与小肠黏膜受体结合的重要候选基因,成功运用于外来品种(如杜洛克猪)F18大肠杆菌的抗性育种[3-4],并且FUT1属于鞘糖脂合成通路基因。综合以上研究表明,Toll样受体信号通路(包括CD14、TLR5、IL-1β等基因)和鞘糖脂合成相关通路(包括FUT1、FUT2等基因)可能在断奶仔猪F18大肠杆菌抗性中均发挥重要的调控作用。然而,本研究发现,Toll样受体信号通路和鞘糖脂合成通路在培育品种—苏太猪(梅山猪×杜洛克)F18大肠杆菌抗性中均发挥重要调控作用,而梅山断奶仔猪中仅仅发现Toll样受体信号通路与F18大肠杆菌抗性有关[11];在引进品种(如杜洛克猪)成功实现抗病育种的FUT1标记在几十个国内地方猪品种(包括梅山猪)中呈现极端偏态分布[5-9];本研究还发现,FUT2在苏太猪抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的表达水平存在显著差异(P < 0.05),而F18大肠杆菌抗性型与敏感型梅山猪中FUT2表达水平差异不显著(P>0.05)。结合课题组对中国地方猪品种(梅山猪)和培育品种(苏太猪)F18大肠杆菌感染的分子调控机制分析以及相关报道综合表明,引进与地方猪种F18大肠杆菌抗性的遗传基础确实存在差异,Toll样受体信号通路及其CD14、TLR5基因在中国地方猪品种—梅山猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥重要的免疫调控作用,而鞘糖脂合成通路及FUT2基因在外来品种及苏太猪(具有外来品种血统)调控F18大肠杆菌受体形成过程中发挥重要作用,但是该结论主要基于国内外前期关于外来品种F18大肠杆菌抗性的相关研究报道,下一步还需要在外来品种(如杜洛克猪)中利用前期梅山猪F18抗性相关通路和功能基因的验证策略[11]来进一步的求证。
4 结论本研究利用比较转录组学分析了中外杂交培育品种—苏太猪F18大肠杆菌抗性的分子调控机制,并从mRNA、蛋白质、个体和细胞水平上验证发现,TLR5、IL-1β基因在梅山猪和苏太猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥重要的免疫调控作用,而FUT2基因仅在苏太猪(具有外来品种血统)调控F18大肠杆菌受体形成过程中发挥重要作用,由此推测,引进与地方猪品种F18大肠杆菌抗性的遗传基础存在差异,对于解释引进与地方猪品种存在抗病力差异这一现象具有重要的科学意义。
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