通过对奶牛牛群遗传改良和奶牛个体特别是种公牛的选种选配，可以提高奶牛个体的生产性能，以提高荷斯坦牛的生产效益和奶牛场经济效益，从而达到遗传改良的目的。而系谱记录的准确性对于奶牛的遗传改良至关重要。但是由于奶牛人工授精技术的广泛普及和牛群系谱记录过程中出现的人为失误，使得系谱记录存在一定的错误率。在荷斯坦牛育种中错误系谱信息比例为3%~23% ^[1-3]。由于错误系谱信息 (Wrong sire information，WSI) 的存在，导致估计遗传力 (h²) 偏低，降低了遗传进展^{[1, 4-5]}。错误的系谱信息会导致育种的偏差进而导致巨大的经济损失^[6]。美欧等畜牧业发达国家已经建立起自己国家的亲子鉴定体系，而中国大多数奶牛场多为纸质的人工记录，错误率较高、信息不完整^[7]，且中国亲子鉴定体系起步较晚，亟待解决。微卫星技术是比较成熟的亲子鉴定工具，且具有成本低，可靠性高，方便使用等优点，适用于奶牛的亲子鉴定。

微卫星DNA标记是第二代分子标记技术，由于其较短的重复碱基数和较少的碱基序列重复次数所以也被称为短串联序列重复 (Short tandem repeats，STR) 或简单序列重复 (Simple sequence repeats，SSR)。微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分，主要由串联重复单元组成，每单元长度在1~10 bp之间。微卫星具有多态信息含量 (Polymorphism information content，PIC) 丰富、杂合度 (Heterozygosity，He) 高、等位基因数目多、在畜群基因组DNA中分布广泛等优点，因此广泛用于畜禽亲子鉴定。本研究着眼于山东乃至全国中小型荷斯坦牛场良种奶牛依赖进口，奶牛利用年限低、淘汰率高等弊端，以及牛场普遍存在的牛群系谱记录错误、丢失和无系谱等现象，在前人研究的基础上拟初步建立一套经济、简便且适合中国荷斯坦牛 (含进口良种荷斯坦牛) 的亲子鉴定方法，为牛群改良计划提供亲子鉴定及系谱建制方法，同时为良种奶牛的选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验动物为中国荷斯坦牛，采自山东佳宝乳业有限公司300头荷斯坦牛血样和毛囊样品，山东奥克斯生物技术有限公司提供9头荷斯坦种公牛冻精样品。整理300头荷斯坦牛系谱记录及其生产性能数据，为亲子鉴定及生产性状关联分析做准备。

1.2 基因组DNA提取

血样DNA采用试剂盒 (天根生化科技有限公司，北京，DP348) 提取，毛囊样DNA采用DP318试剂盒提取。冻精样DNA使用高盐法提取。检测基因组DNA的浓度及纯度 (OD_{260 nm}/OD_{280 nm}为1.70~1.85)，同时采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，保证条带整齐无拖尾。检测合格的基因组DNA于－20 ℃保存。

1.3 微卫星标记筛选

在前人研究的基础上^[8-9]，经国际动物遗传学会 (The International Society for Animal Genetics，ISAG，http://www.isag.us/) 和联合国粮食及农业组织 (Food and Agriculture Organization，FAO，http://www.fao.org) 推荐，筛选获得18个微卫星位点 (BMC1207、TGLA227、TGLA122、TGLA226、BM1329、BM9065、BMS1943、BM103、MB026、BMC1410、MAF70、BMS1248、BP1、INRA037、INRA134、BP7、BMS1290和BM6425) 的信息，经PCR扩增获得可高效扩增且多态性高的8个微卫星位点 (表 1)，用于中国荷斯坦牛的系谱鉴定。

1.4 PCR反应体系、条件及产物检测

将8个微卫星位点进行5′端荧光引物设计，并进行批量PCR扩增，PCR扩增体系为15 μL：DNA模板0.5 μL (20 ng·μL^-1)，上、下游引物各0.25 μL，dNTP mixture (2.5 mmol·L^-1)1.0 μL，10×PCR buffer (10×(Mg²⁺ plus)) 1.5 μL，RTaq酶 (5 U·μL^-1)0.25 μL，ddH₂O 11.25 μL。可在体系中加入少量的DMSO (0.5~1.0 μL)，以减少或避免引物二聚体等杂带的产生。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火温度 (表 1，Tm) 退火30 s，72 ℃延伸30 s，以上三步循环30~35次；72 ℃延伸10 min；降温至4 ℃结束。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行荧光毛细管电泳。

1.5 数据分析

本研究主要使用Cervus 3.0(Softpedia Team) 和SAS8.2(SAS Institute Inc., Cary, USA) 等分析软件对所得数据进行分析处理：

(1) 等位基因及等位基因频率 (Allele, Allele frequency)：

${P_i}{\rm{ = }}\left[ {2\left( {ii} \right) + \left( {i{j_1}} \right) + \left( {i{j_2}} \right) + \cdots + \left( {i{j_n}} \right)} \right]/(2N)$

P_i为第i个等位基因的频率，ii为第i个等位基因纯合体的个数，j_n为与i共显的第n个等位基因，ij_n为含有i与j_n共显等位基因的个体数，N为个体总数。用Cervus 3.0软件计算获得。

(2) 有效等位基因数 (Effective number of alleles，Ne)：

$Ne = 1/\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} $

P_i为第i个等位基因的频率，n为等位基因个数。用Cervus 3.0软件计算获得。

(3) 杂合度 (Heterozygosity，He)：

在Cervus 3.0中将杂合度分为观察杂合度和期望杂合度，观察杂合度即为杂合子占所有分型个体的比例，期望杂合度即被研究的微卫星位点处于Hardy-Weinberg平衡时，杂合子占总分型个体的比值。计算公式：

杂合度$He = 1 - \sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} $

平均杂合度$H = \sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2/n} $

P_i为第i个等位基因频率，n为等位基因数。用Cervus 3.0软件计算获得。

(4) 多态信息含量 (Polymorphism information content, PIC)：

$PIC = 1 - \sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} - \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {\sum\limits_{j = j + 1}^n {2P_i^2P_j^2} } $

P_i、P_j分别为第i、j个等位基因频率，n为等位基因数。用Cervus 3.0软件计算获得。

(5) 排除概率 (Probability of exclusion，PE)：

排除概率是指单个位点能够排除给定子代与亲代的概率，是评价微卫星位点在亲子鉴定中使用价值大小的一个重要指标。用Cervus 3.0软件计算获得。

① 当一亲本基因型未知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的概率

$\begin{array}{l} PE - 1 = 1 - 4\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} + 2{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} } \right)^2} + \\ 4\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^3} - 3\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^4} \end{array}$

② 当一亲本基因型已知时，排除子代与假设亲本是亲子关系的概率

$\begin{array}{l} PE - 2 = 1 - 2\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} + \sum\limits_{i = 1}^n {P_i^3} + 2\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^4} - \\ 3\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^5} - 2{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} } \right)^2} + 3\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^3} } \end{array}$

③ 排除子代与无关的假设父母对是亲子关系的排除概率

$\begin{array}{l} PE - {\rm{P}} = 1 + 4\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^4} - 4\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^5} - 3\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^6} - \\ 8{(\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} )^2} + 8\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^3} } + 2{\left( {\sum\limits_{i = 1}^n {P_i^3} } \right)^2} \end{array}$

其中，n代表每个STR标记的等位基因数，P_i代表第i个等位基因的频率。

④ 第i个标记的结合排除概率为CPE=1-(1-P₁)(1-P₂)(1-P₃)…(1-P_i)

(6) NJ系统发育树的建立

系统进化树 (Phylogenetic tree) 也可以称为系统发育树。它是用近似于树枝状的分支图来表示生物之间亲缘关系的远近，常用的构建系统进化树的方法有两种：非加权配对算术平均法 (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages, UPGMAA) 以及邻近结合法 (Neighbor-Joining, NJ)。邻近结合法是一种可用DNA的同源性来建立亲缘关系的方法，该法依赖遗传距离矩阵资料，由序列建立支序图或亲缘关系图的方法，再利用距离矩阵的资料画出树型。本试验基于个体基因型数据，由moklin 3.0软件根据基因型数据，计算出各个体间的遗传距离，再利用MEGA 5.0软件，基于NJ法，绘出基于遗传距离的NJ系统发育树。

遗传距离的计算公式 (Nei氏法)：

${D_s} = - Ln\left[ {{J_{xy}}/{{({J_x}{J_y})}^{1/2}}} \right]$

其中，${J_x} = \sum\limits_{i = 1}^r {\sum\limits_{j = 1}^k {X_{ij}^2/n} } ;{J_y} = \sum\limits_{i = 1}^r {\sum\limits_{j = 1}^k {Y_{ij}^2/n} } ;{J_{yx}} = \sum\limits_{i = 1}^r {\sum\limits_{j = 1}^k {{X_{ij}}{Y_{ij}}/n} } $

X_ij、Y_ij分别为群体中第r个座位上第k个等位基因的频率。

2 结果 2.1 微卫星标记的遗传多态性研究

运用Cervus 3.0软件进行8个微卫星位点的等位基因数和有效等位基因数分析。有172个个体在8个位点均检测到了STR分型。8个微卫星位点均表现出较多的等位基因数目，平均等位基因数为14.63(表 2)。

2.2 多态信息含量 (PIC)、杂合度与排除概率

使用Cervus 3.0软件的Allele Frequency Analysis程序，计算各个标记的多态信息含量、期望杂合度、观察杂合度和排除概率，结果如表 3所示。

8个微卫星位点的PIC值均大于0.50，平均PIC值为0.747，8个标记均为高度多态性位点。8个位点观察杂合度 (Ho) 从0.558(MB026) 到0.831(BM103) 不等，变化范围较小，平均观察杂合度为0.718；8个位点间期望杂合度 (He) 从0.563(MB026) 到0.878(TGLA227) 不等，变化范围较小，平均期望杂合度为0.773。在给定一个候选亲本与子代信息的情况下 (PE-1)，8个位点的排除概率 (PE-1) 为0.181(MB026)~0.601(TGLA227)，在给定一个亲本基因型、候选亲本基因型和子代基因型的情况下 (PE-2)，8个位点的排除概率为0.352(MB026)~0.752(TGLA227)，在给定候选父母双方基因型的情况下 (PE-P)，8个位点的排除概率为0.544(MB026)~0.907(TGLA227)。

2.3 微卫星位点亲权鉴定体系的建立

为鉴定8个微卫星位点的亲子鉴定效率，依照表 3中各位点排除概率由大到小的顺序，将8个微卫星位点按组合数目进行分组，计算其结合排除概率 (CPEs)，结果见表 4。由表 4可得，微卫星位点个数为8时，3种结合排除概率均达到或超过0.990，8个高多态性的微卫星位点 (TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026) 可作为中国荷斯坦牛的亲子鉴定体系。随着位点个数的减少，结合排除概率逐渐减小，当位点个数低于8时，CPE-1小于0.990，微卫星位点在3~8个时CPE-1大于90%，仍可为奶牛亲子鉴定提供一定的参考价值。

微卫星位点个数为4时，CPE-2为0.991，大于99%，所以当微卫星位点个数大于等于4个时，完全可用于子代一亲本基因型已知情况下的亲子鉴定。

2.4 分子系谱的建立

为了比较微卫星组合在奶牛分子系谱建立中的差异性，本试验根据172个个体不同微卫星组合的基因型数据，基于个体间遗传距离绘制了奶牛群体的NJ系统发育树 (图 1)。由图 1可见，不同位点组合，个体分支差异较大，4个位点组合和5个位点组合个体分支较少，与6个及6个以上位点分支情况有较大差异。由表 5可见，同时4个位点组合和5个位点组合计算的群体近交系数 (F_is和F_st) 较大，但4个和5个位点组合共祖系数 (F_ij) 变化不明显。位点个数≥6个时各参数发生明显变化，且与7个或8个位点的参数之间数值变化不明显，因而推断，利用其中6个位点 (TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037和INRA134) 就可以用于中国荷斯坦牛的亲子鉴定和系谱构建。

2.5 微卫星位点亲子鉴定效力的验证

从采样群体中选择有纸质系谱记录的8个父子亲本对进行验证，选择1个无关父亲 (Sire ID 37310026) 作为阴性对照。运用Cervus 3.0软件中Analysis程序的Parentage Analysis模块进行数据分析，通过分析这8个亲子对和1个无关父亲的微卫星基因型及其基因频率，鉴定结果见表 6。表中LOD值是亲子指数 (Paternity index) 的对数值，LOD值大于0的则表示与任意个体相比，候选亲本 (Candidate parent) 最有可能是真实的亲本；LOD值小于0表示与任意个体相比，候选亲本不可能是真实的亲本。其中无关父本LOD均＜0，Delta为0~7.68，根据亲子关系模拟的结果显示，当Delta值＞2.48时，可信度超过95%；当0＜Delta＜2.48时可信度达到80%，5个亲子对亲子关系置信度大于95%，1个亲子对亲子关系置信度达到85%，2个亲子对间无亲缘关系，说明系谱记录存在一定的错误率。该结果进一步验证8个微卫星位点组合基本满足荷斯坦牛亲子鉴定的要求。

3 讨论 3.1 分子系谱鉴定标记类型选择

分子标记作为一种理想的遗传标记，已广泛应用于畜禽亲子鉴定中。分子标记大概包括以下几种类型：限制性片段长度多态性 (RFLP)、扩增片段长度多态性 (AFLP)、线粒体DNA标记 (mtDNA)、小卫星DNA标记 (Minisatelite DNA)、微卫星DNA标记 (STR) 和单核苷酸多态性标记 (SNP)。其中RFLP、AFLP、mtDNA和小卫星DNA标记属于第一代分子标记，且其中部分标记已成功用于奶牛的亲子鉴定^[10-11]，但由于其标记多态性较低，试验操作复杂繁琐，且部分标记试验成本较高，故被第二代和第三代分子标记所取代。SNP标记是第三代遗传标记。SNP只有两个等位基因，即双等位基因，且单个SNP位点多态性低于微卫星位点，等位基因数目也少于STR位点，且SNP位点检测成本高^[12-13]，所以使用STR位点对家畜进行亲子鉴定仍是首选。微卫星标记广泛分布于真核生物基因组中，且多态性高，具有较高的多态信息含量，标记遗传稳定性好，所以广泛应用于家畜特别是奶牛的亲子鉴定工作中。

3.2 微卫星位点的选择

8个微卫星位点均表现出较多的等位基因数目，8个微卫星位点的平均等位基因数为14.63，表现出很高的多态性，等位基因数目较多，符合分子系谱鉴定的要求。其中微卫星位点TGLA227、TGLA122、INRA037等位基因数较多，多态信息含量较高^{[8, 14-15]}。位点BM103、MB026、BP7等位点等位基因数和PIC值与国外相比均较低，这可能与中国荷斯坦牛的品系有关，且与本试验采样群体规模和采样区域有一定关系^[16]。

3.3 亲子鉴定或分子系谱构建中微卫星位点组合的选择

E.Ozkan等运用12个微卫星位点 (其中9个位点为ISAG推荐) 评估7个土耳其荷斯坦公牛家系 (21个雄性子代和64个雌性孙子代) 系谱鉴定的可行性，发现9个位点当候选双亲基因型已知时，结合排除概率 (CPE) 为99.9%，可进行奶牛亲子鉴定^[17]。杨超等选取国际动物遗传学会 (ISAG) 推荐的12个微卫星位点，对571头荷斯坦种公牛进行基因型检测。统计结果显示，12个微卫星标记的累积排除概率大于0.996^[18]。本试验中, 8个微卫星位点的结合排除概率在3种情况下均达到99%，完全能够满足奶牛群体亲子鉴定要求。根据单个位点排除概率由大到小排列，将8个微卫星位点按组合数目进行分组，计算其结合排除概率。随着位点个数的减少其结合排除概率逐渐减小，但在生产实践中，满足95%的结合排除概率即可以判断几个错误亲本对的亲子关系，因此4个高多态性位点 (TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103) 就可以满足一般奶牛场个别牛只间的亲子鉴定。

但对于构建群体分子系谱而言，当微卫星位点个数为6个时，其群体CPE-1为98.1%，CPE-2为99.8%，理论数据未能达到试验条件下99%的结合排除概率，同时在MEGA软件构建的系统发育树中可得，当位点个数为6个时，发育树分支较7个和8个位点的发育树分支情况差异不显著 (发育树中个体分支情况变化不明显)，但与4个和5个位点的发育树差异显著 (发育树中个体分支情况变化明显)。本试验利用个体基因型进行亲缘关系鉴定，发现在位点个数为6时，真实父本错误基因型个数≤2，假设父本错误基因型个数均≥3个，这与构建的系统发育树基本相对应。位点个数小于6个时，发育树分支情况变化明显，同时利用基因型数据进行亲子鉴定时，会出现假设副本错误基因型个数小于2的情况，故试验表明6个位点能够满足生产中进行 (小规模) 群体亲子鉴定的要求。位点个数为4个或5个时可以用于生产中较少个体的亲子鉴定 (只有真实亲本、假设亲本和子代3个个体)，并作为参考，建议使用6个或6个以上微卫星位点进行亲子鉴定。本试验构建的分子系谱将为实际记录的纸质系谱的准确性确认提供重要依据。

4 结论

本研究筛选的8个微卫星位点TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037、INRA134、BP7和MB026，等位基因数目多，PIC值较高，呈高度多态性，可作为中国荷斯坦牛亲权鉴定和分子系谱构建体系的核心分子标记。其中，微卫星位点TGLA227、TGLA122、BMC1207和BM103推荐用于个别案例牛的亲子鉴定。TGLA227、TGLA122、BMC1207、BM103、INRA037和INRA134位点推荐用于小规模群体分子系谱的构建。