水曲柳(Fraxinus Mandshurica R.)属于木犀科(Oleaceae)梣属(Fraxinus)植物, 别名, 东北梣, 主要分布于我国东北黑龙江的大兴安岭东部和小兴安岭、吉林的长白山等地。其树皮具有抗炎镇痛之功效, 常作秦皮的替代品使用^[1]。《新华本草纲要》也记载了它的皮味苦, 性寒, 具有清热燥湿, 清肝明目的功能, 用于肠炎、痢疾、月经不调、白带、慢性支气管炎、急性结膜炎、疟疾的治疗^[2]。

梣属(Fraxinus)植物种子中所含的化学成分种类比较多, 主要有环烯醚萜类、酚苷类、香豆素类、木脂素类、黄酮类等化合物^[3-7]。因此，水曲柳种子具有较高的药用价值和食用价值, 药理研究发现, 其主要有抗炎镇痛、抗病原微生物、利尿、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种药理作用^[8-17]。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PU-FA)具有抗癌、抗氧化、保肝促进细胞生长抗心脑血管疾病等作用^[18]。本文拟采用乙醇提取, 气相色谱与质谱联用技术(Gas Chromatography and Mass Spectrometry, GC-MS)分析水曲柳种子所含有的小极性脂肪酸成分, 为水曲柳种子下一步的研究和开发利用提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

水曲柳种子:水曲柳种子2015年12月年于吉林购买, 经西北大学白乃生鉴定, 留样于西北大学。

试剂:水曲柳种子提取分离使用的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均为工业级; 乙醚(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司; 正己烷(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司; 氢氧化钠(分析纯)购自天津市恒兴化学试剂制造公司; 甲醇(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司; 氯化钠(分析纯)购自天津市河东区红岩试剂厂; 无水硫酸钠(分析纯)购自天津市河东区红岩试剂厂; 纯净水。

1.2 仪器

GC-MS 2010-plus气相色谱-质谱联用仪, 配有电子轰击离子源, 四级杆质量分析器; GC-MS-Solution数据处理系统(日本岛津公司); NIST-05版质谱图库; KQ3200DE超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司); FA1204电子天平(天津康亨达电子衡器有限公司); QE-500粉碎机(武义县屹立工具有限公司); R-1001VN旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司); WB-2000恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司); SHB-Ⅲ循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司); DLSB-5/10低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.3 方法与条件 1.3.1 提取

取水曲柳种子30kg, 粉碎后加入3倍体积的乙醇-水(体积比为9：1)在室温下浸泡提取3次。每次48h, 将提取液合并浓缩后, 溶剂回收重复使用, 得到墨绿色的浸膏(1.441 kg)和褐色油状物。将提取浸膏用适量的水分散后, 先后分别用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次, 将各个萃取部位进行浓缩, 得到二氯甲烷萃取物(0.388 kg)、乙酸乙酯萃取物(0.089 kg)、正丁醇萃取物(0.433 kg)及水层部分(0.485 kg)。对提取后的滤渣先后分别用适当体积50L的体积比为1：1的乙醇和水提取, 分别浓缩成浸膏, 待后续处理。

二氯甲烷层整体极性偏小, 用0.075~0.150mm硅胶, 石油醚(PE)-乙酸乙酯(EtOAc)梯度洗脱, 柱分离粗分划断为7个馏分(组分1~7), 组分1~3为大量的黄褐色油状物质, 在TLC跟踪检测时发现极性很小, 但其中的化合物极性很相近。因此，为了全面掌握二氯甲烷层中的主要成分, 对组分1~3极性很小的油脂性成分进行脂肪酸GC-MS组成分析。

1.3.2 脂肪酸甲酯化

称取组分1~3各0.200 g, 加入0.5 mol/L氢氧化钠的甲醇溶液6mL, 充分震荡后放入60℃的恒温水浴锅中。放置1h后取出, 加入提前配好的10% H₂SO₄—MeOH溶液至酸性(大约加入了7mL)。然后放入60℃的恒温水浴锅中, 1h后将样品取出自然放置使其冷却。加入8mL正己烷、4mL水进行萃取, 离心后取出上清液并加入无水硫酸钠进行干燥处理。处理后的样品用0.22μm微孔过滤头进行过滤, 预处理结束待分析。

1.3.3 GC-MS分析

气相色谱(GC)条件:Rtx-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25 mm×0.25 μm); 以99.99%(体积分数)的氦气为载体, 柱前压力为83 kPa; 流速为1.05 mL/min, 进样口的温度为250℃, 进样量为1.0 μL, 分流比30：1(体积比), 计算各峰相对含量。采用程序升温法, 色谱柱的初始温度为100℃, 保持这个温度2min, 然后以10℃/min升温至210℃, 再以1.5℃/min升温至230℃, 保持1min。最后以5℃/min升温至250℃, 此升温过程结束。

质谱(MS)条件:采用EI电离源, 电子能量为70eV, 离子源温度为220℃, 四级杆温度为150℃, 接口温度是280℃, 扫描方式为间歇扫描, 质量范围为m/z 50-500, 数据采集时间为2~22min。

1.3.4 数据处理

测定方法。取脂肪酸甲酯化样品1μL, 用GC-MS仪测定, 通过色谱工作站数据处理系统检索NIST-05谱图库, 结合有关文献进行人工谱图解析, 确认脂肪酸及其他化学成分。通过GC-MS Solution色谱工作站数据处理系统按面积归一化法进行定量分析, 分别求出各脂肪酸成分的相对百分含量。

2 结果与分析

将组分1，2，3采用上述GC-MS分析条件进行分析, 得到相对应组分的脂肪酸成分总离子流色谱图(图 1, 2, 3)，对所含组分进行NIST-05谱库检索, 并根据离子峰质谱解析、结构筛选, 最终初步确认所含组分的可能结构。同时，应用面积归一化法, 通过GC-MS Solution色谱工作站数据处理系统求得各脂肪酸成分的相对质量分数(表 1)。

综合3个组成分来看, 水曲柳种子中含有较高的不饱和脂肪酸, 其中主要为多烯脂肪酸、亚油酸及油酸、芳环脂肪酸及不饱和脂肪酸, 各类脂肪酸成分的含量相对较高, 且在GC-MS中能够做出较好的定性和定量分析。

结果表明, 从组分1中分离鉴定出4种脂肪酸, 均为不饱和脂肪酸, 其占组分1脂肪油总量的14.69%(质量分数), 主要种类有十六烯酸(1.18%，质量分数)，(Z, Z)-9, 12-十八碳二烯酸(4.88%，质量分数)，9-十八碳烯酸(5.36%，质量分数)，8-硬脂酸(2.66%，质量分数)、顺-11-二十烯酸(0.91%，质量分数)等; 这几个脂肪酸均在组分2也有中发现。从组分2中分离鉴定出14种脂肪酸, 其中含10种不饱和脂肪酸, 其占组分2脂肪油总量的30.37%(质量分数), 主要种类有癸烯酸(0.51%，质量分数)、蓖麻油酸(0.80%，质量分数)、亚油酸(0.48%，质量分数)、9-十六烯酸(0.69%，质量分数)、十六烯酸(3.47%，质量分数)、对羟基苯丙酸(0.63%，质量分数)、9, 13-十八碳二烯酸(7.11%，质量分数)、反油酸(5.33%，质量分数)、硬脂酸(1.34%，质量分数)、顺-11-二十烯酸(0.91%，质量分数)等; 含有饱和脂肪酸4种, 其含量占脂肪油总量的6.31%(质量分数), 主要种类有二十烷酸(1.30%，质量分数)、二十二烷酸(1.00%，质量分数)、十九酸(3.60%，质量分数)、二十四碳酸(1.41%，质量分数)等。两类脂肪酸质量分数占组分2脂肪油总量的36.59%。从组分3中分离鉴定出16种脂肪酸, 均为不饱和脂肪酸, 其含量占组分3脂肪油总量的48.96%, 主要种类有9-棕榈油酸和棕榈油酸总共(3.3%，质量分数)、各类亚油酸(17.7%，质量分数)、多烯脂肪酸(24.20%，质量分数)以及其他各种芳环脂肪酸(7.07%，质量分数)。

3 结论

水曲柳种子中所含有的脂肪酸成分主要以不饱和脂肪酸为主, 其中有多种多烯脂肪酸(Polyene fatty acid)，具有降低血脂、甘油三酯、总胆固醇作用, 提高高密度脂蛋白, 降低血黏度, 减少血小板聚集和血栓形成作用, 以及防止冠心病猝死及抗肿瘤作用^[19]。亚油酸(Octadecenoic acid)也有多种药理作用, 可以降低实验鼠和人体的血胆固醇和β脂蛋白, 并可以防治动脉粥样硬化和血栓的形成^[20]。多存在于海产品中的棕榈油酸, 在水曲柳种子中有微量存在, 棕榈油酸对肥胖症、高血糖有很好的缓解作用^[21]。由此可见, 水曲柳种子中的小极性脂肪酸也有较高的营养价值和药用价值。