石菖蒲是天南星多年生草本植物石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.)的干燥根茎。味辛性温, 具芳香之气, 既能芳香化湿、醒脾健胃, 又可化浊祛痰、开窍宁神, 是芳香宁神, 涤痰开窍之药^[1]。石菖蒲主要活性成分为石菖蒲挥发油, 其具有神经细胞保护活性^[2]、抗血栓作用^[3]、可减轻低氧诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞线粒体损伤^[4]、防治阿尔茨海默病^[5]、体外抗神经胶质瘤作用^[6]、促进罗丹明123的肠吸收^[7]、还具有抗动脉硬化、抗抑郁等^[8]。石菖蒲挥发油提取常采用的溶剂体系为水、超临界CO₂流体, 采用的方法有水蒸气蒸馏、水煎、超临界^[9-11], 离子液体作为继水和超临界二氧化碳后的又一大类绿色溶剂, 但将离子液体用于石菖蒲挥发油提取方面的研究未见报道。

离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的一种低温熔盐, 具有独特的物理化学属性, 如良好的热稳定性、化学稳定性、几乎没有蒸汽压、良好的传热与传质性能、对很多有机和无机物质表现出良好的溶解能力、结构可修饰性等^[12-14], 以及修饰和改变阴阳离子的结构和种类来控制离子液体的物理化学性质。作为“绿色溶剂”, 离子液体在天然产物的分离分析方面的应用成为研究的热点^[15], 特别是其在中药活性成分提取方面引起了研究者的广泛关注, 如挥发油^[16]、有机酸^[17-18]、生物碱^[19]、木质素^[20-21]、黄铜^[22-23]、香豆素^[24]等的提取, 但是目前有关离子液体用于活性成分提取方面研究仍然很少。

本研究以1-烷基-3-甲基咪唑类离子液体为辅助溶剂, 通过改变离子液体种类、离子液体加入量, 加入方式, 并与传统石菖蒲挥发油提取方法比较, 研究提取条件对石菖蒲挥发油提取率的影响。建立离子液体辅助提取石菖蒲中挥发油的提取方法。研究离子液体在石菖蒲挥发油提取中可能的作用机制, 为未来离子液体在中药提取方面的应用提供重要的研究基础和理论依据。

1 仪器、试剂与药品

1-烷基-3-甲基咪唑类离子液体(自制), 丙酮(利安隆博华医药化学有限公司, 色谱纯), 无水硫酸钠(AR, 国药集团化学试剂有限公司); 石油醚(AR, 沸程30~60℃, 利安隆博华医药化学有限公司); 其他试剂均为分析纯。石菖蒲(经药学院生药教研室张彦老师显微鉴别为天南星科菖蒲属石菖蒲Acorus tatarinowii Schott.的干燥根茎):恒温干燥粉碎, 过4号筛(筛孔内径为250 μm±9.9 μm)。

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司); RE-2000A型旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司); SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司); DZF-6020型真空干燥箱(上海琅玕实验设备有限公司); Agilent 5975C/7890A GC-MS联用仪(美国Agilent公司)。

2 实验部分 2.1 石菖蒲挥发油的提取及提取率计算 2.1.1 纯水溶液提取

称取10 g石菖蒲药材粉末, 药材质量(g)与水的体积(mL)比为1:8, 超声15 min (20℃，200 W), 浸泡2 h, 水蒸气蒸馏法提取6 h^[25]。收集挥发油, 加入石油醚萃取, 无水硫酸钠脱水, 过滤, 40℃旋蒸除去石油醚。计算提取率, 根据2015版《中华人民共和国药典》规定方法计算。

$提取率\% = \frac{m}{M} \times 100\% $

(1)

式中:m表示挥发油的质量，g；M表示药材的质量，g。

2.1.2 NaCl水溶液提取

称取10 g石菖蒲药材粉末, 药材质量(g)与NaCl水溶液的体积(mL)比为1:8, 加入NaCl的量分别为药材量的5%，10%，15%(质量分数), 超声15 min(20℃, 200W), 浸泡2 h, 水蒸气蒸馏法提取6 h, 收集挥发油, 后处理同2.1.1。依据公式(1)计算挥发油提取率。

2.1.3 不同离子液体种类、比例、加入方式

1) 不同离子液体种类

称取10 g石菖蒲药材粉末, 药材质量(g)与离子液体-水溶液的体积比为1:8, 离子液体与水的体积比为1:60, 分别量取等量的1-辛基-3-甲基咪唑溴盐([OMIM]Br)，1-己基-3-甲基咪唑溴盐([HMIM]Br)，1-丁基-3-甲基咪唑溴([BMIM]Br)，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([HMIM]BF₄)，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF₄)，1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([OMIM]PF₆)作为辅助提取剂, 加入圆底烧瓶, 浸泡2 h, 水蒸气蒸馏法提取6 h, 收集挥发油, 后处理同2.1.1, 依据公式(1)计算各离子液体辅助提取挥发油的提取率。

2) 离子液体与水比例的选择

以[OMIM]Br为辅助提取剂, 设定离子液体与水的体积比分别为1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:60, 混合后加入烧瓶, 浸泡2 h, 水蒸汽蒸馏法提取6 h。收集挥发油, 后处理同2.1.1, 按公式(1)计算离子液体、水不同体积比时挥发油的提取率。

3) 离子液体加入方式的选择

称取10 g石菖蒲药材粉末, 按离子液体与水的体积比为1:10, 1:20, 1:30，先加入[OMIM]Br, 浸泡, 搅拌1 h, 再按比例加入水浸泡2 h, 提取6 h后处理同2.1.1, 按公式(1)计算挥发油的提取率。

2.2 供试品溶液制备

取100 μL挥发油, 用丙酮定容至10 mL容量瓶, 得10 μL/mL挥发油溶液; 再取500 μL定容至10 mL容量瓶中, 得0.5 μL/mL样品溶液; 加入无水硫酸钠后, 过0.45 μm滤膜, 得供试品溶液。

2.3 GCMS条件

GC Agilent HP-5MS色谱柱(30m×250 μm×0. 25 μm), 进样口温度250℃, 接口温度280℃, 载气为氦气, 流速1.0 mL/min, 分流比为10:1, 进样量为1.0 μL; 升温程序:起始温度50℃, 6℃/min程升到130℃, 然后1℃/min程升到160℃, 保持2 min, 再20℃/min程升到260℃, 保持2 min。

MS:EI离子源, 电子轰击能量70 eV, 离子源温度230℃, 四极杆温度150℃, 接口温度280℃, 溶剂延迟时间3 min, 质量范围35~450 aum全程扫描。

3 结果与讨论 3.1 不同提取溶剂对挥发油提取率的影响

研究发现, 用水提取时, 石菖蒲挥发油的提取率为1.58%;NaCl的量为药材量的5%，10%，15%(质量分数)时, 挥发油的提取率分别为0.93%，2.16%和1.11%(n=3, RSD≤3%)。结果提示, NaCl的量为药材量的10%提取率最佳, 且高于水作为溶剂时的提取率。当NaCl的量为药材量的5%，15%(质量分数)时, 挥发油的提取率比水溶液提取率小。原因是挥发性成分包含水溶性和油溶性成分, 当NaCl量小时, 阻碍水溶性成分从药材向水中迁移; 当NaCl量适中时, 利于油溶性成分从水中析出; 当NaCl量更大时, 又阻碍了油溶性成分从药材向水中迁移。

比较水、NaCl水溶液、[OMIM]Br浸泡和[OMIM]Br-水(体积比1:20)4种溶剂体系对石菖蒲挥发油的提取率, 发现[OMIM]Br-水(体积比1:20)(>[OMIM]Br浸泡> NaCl水溶液>水(n=3, RSD≤4%)。这是由于离子液体具有破坏纤维素, 溶解细胞壁的作用, 在浸泡过程中使挥发油更易从植物进入到提取液中, 使提取率增加。加NaCl起到盐析作用, 降低了挥发油在水中的溶解度, 使饱和蒸气压中挥发油含量增加。由于纯的[OMIM]Br黏度较大, 浸泡时易聚集, 不易分散, 挥发油被包裹于其中, 而不易完全随水蒸气蒸馏出来。

3.2 不同离子液体对挥发油提取率的影响

离子液体与水体积比例为1:60时, [BMIM]Br，[HMIM]Br，[OMIM]Br，[BMIM]BF₄，[HMIM]BF₄和[OMIM]PF₆离子液体对石菖蒲挥发油的提取率分别为1.79%，2.23%，2.69%，0.42%，0.70%和0.69%(n=3, RSD≤4%)。与水作溶剂提取率相比, 实验中所用的6种离子液体中, N-甲基咪唑类溴离子液体能够提高石菖蒲中挥发油的提取率。随着烷基链长的增长, 挥发油的提取率增加, [OMIM]Br离子液体的提取率最佳; N-甲基咪唑类四氟硼酸盐和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐均使挥发油的提取率降低。其主要原因有两个方面:离子液体影响挥发性成分的传质, 即从药材向溶剂体系的转移; 离子液体与挥发油间的作用力影响其在水蒸汽中的分配。离子液体[RMIM]PF₆，[RMIM]Br，[RMIM]BF₄的极性依次增大。依据相似相溶原理, [RMIM]PF₆的提取率应最佳, 但由于[RMIM]PF₆的极性过小, 与挥发油的作用力最强, 使得挥发油很难被水蒸气带出。[RMIM]BF₄为水溶性离子液体, 不能将更多的挥发油从植物组织中带出来, 提取效果不佳。[RMIM]Br的极性随烷基链的增长, 疏水性增强, 与挥发油的作用增强, [RMIM]Br又溶于水, 起到表面活性剂的作用, 再加上离子液体破坏纤维素, 溶解细胞壁和传质作用, 使更多的挥发油被提取出来, 从而使挥发油的提取率明显增加。

3.3 离子液体与水的比例对挥发油提取率的影响

以[OMIM]Br离子液体为辅助提取剂, 离子液体与水的体积比例分别为1:60，1:50，1:30，1:20，1:10，1:5, 挥发油的提取率分别为1.67%，3.61%，3.95%，3.63%，3.38%和2.69%(n=3, RSD≤5%), 均高于水作溶剂时的提取率。结果提示, 挥发油的提取率随着离子液体的比例增大而增加, 当离子液体与水体积比为1:20时, 挥发油的提取率最佳, 继续增加[OMIM]Br的量, 挥发油的提取率随着[OMIM]Br的增大而减小。同时，对离子液体加入方式研究发现, [OMIM]Br离子液体与水混合浸泡药材后, 挥发油提取率明显高于[OMIM]Br浸泡药材再与水混合的加入方式(表 1)。

由于[OMIM]Br具有一定的黏度, 随着[OMIM]Br在水中比例的增加, 黏度越来越大, 从而使离子液体在水中的分散能力变差, 易于聚集。先加入离子液体, 聚集的离子液体包裹在药材粉末上, 使挥发性成分难以蒸出。

3.4 挥发油化学成分分析

吸取水、NaCl-水、[OMIM]Br-水(体积比1:60)和[OMIM]Br-水(体积比1:20)提取的供试品溶液各1 μL分别进样分析。采用NIST11标准质谱库对图谱进行检索, 鉴定了4种提取溶剂中共同存在有的30个化合物, 见表 2, 不同溶剂体系的GC-MS图见图 1A~图 1D。

图 1A~图 1D中含量最高的7种化合物, 含量分析结果见表 3。

从表 3可以看出, 离子液体与水体积比为1:20时, β-细辛醚和α-细辛醚的相对含量较水为溶剂提取稍微有所下降, 但其余成分的相对含量均明显增高。从GC-MS分析百分比报告可得, 纯水提取液中有65.2%(n=3, RSD≤3%)的化合物含量在0.1%以上, 而离子液体提取液中, 有83.3%(n=3, RSD≤3%)的化合物含量均在0.1%以上。

4 结论

采用水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲中的挥发性成分, 选用极性特征不同的离子液体作为辅助提取剂。对离子液体的种类, 离子液体-水的比例以及离子液体的加入方式进行了研究, 筛选出离子液体辅助提取的最佳条件。采用GC-MS联用仪分析不同提取方法的样品溶液, 结果表明, 离子液体对石菖蒲挥发油的提取有促进作用, 研究实验结果可为未来离子液体在中药挥发油方面的应用提供重要的研究基础和理论依据。