2017, Vol. 47
AD是老年性痴呆症中常见的型式, 目前全世界大约2420万AD患者, 预计每20年将翻一番, 中国照料痴呆的直接花费大约为每年28亿美元[1-2]。人们普遍认为Aβ是AD的致病主因[3]。AD脑脊液中的Aβ、总tau蛋白含量及磷酸化的tau蛋白(即Aβ1-42, T-tau蛋白和p-tau蛋白)含量, 被用作生物标识物(Biomarkers)加以检测, 这些指标已经成为防治AD不可缺少的一部分[4-5]。
Aβ1-42是β淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)经过β和γ分泌酶水解产生的, 产生后讯速形成可溶性的寡聚体, 这些寡聚体在AD病理起始阶段中发挥着关键的毒性作用[6-7]。Aβ1-42寡聚体并不是单一的几聚体, 而是由很多种寡聚组成, 例如, 3聚体, 4聚体, 56聚体, 高聚的原纤维(Protofibrils)等[6-8], 即便是电镜上观察非常均一的ADDL(Aβ-derived diffusible ligands)也是由从2聚体至24聚体不等的几十种混合物组成的, 很难确定究竟是几聚体在发挥毒性作用。在毒性机制基础研究中, 电泳分析是经常用到的检测方式之一。
Aβ1-42很容易受到变性剂SDS破坏, 还会受到丙烯酰胺胶孔道的挤压, Aβ单体和寡聚体条带常常仅以单体、3聚和4聚3种形式出现, 而不能显示出其本身的聚集形式。这需要使用天然胶或者交联剂, 不被SDS等去垢剂破坏, 研究者使用戊二醛交联或光交联[9-11]来达到分析目的。BS3作为一种易溶于水的化合物在蛋白及抗体的交联过程中曾有过报道[12-13], 本文将详细报道BS3对于Aβ1-42/40的交联, 区分蛋白的单体和各种寡聚体形式, 为AD病理机制的分析提供很好的帮助。
1 材料与方法 1.1 材料表达的Aβ1- 42肽购自rpeptide公司(Athens, GA, 美国), 交联剂BS3购自Sigma.鼠源单克隆抗体DE2, ECL显色剂均购自Millipore (Millipore, MA), 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)、二甲基亚砜DMSO均购自Sigma, F-12培养基(Ham′s F-12, BioSource, 澳大利亚), 透射电子显微镜型号Tecnai G20 (FEI)。
1.2 方法 1.2.1 Aβ1-42单体化处理1mg Aβ瓶中加入222ul HFIP, 在旋涡振荡5min, 4℃慢摇过夜, 按8.6μL/管分装, N2流吹干, -80℃下冻存备用[14]。
1.2.2 ADDL寡聚体和原纤维寡聚体的制备ADDL的制备条件, Aβ1-42加入F12培养基中使得终浓度为100μmol/L, 在4℃孵育24h[15]。原纤维的制备条件, Aβ1-42加入到Tris缓冲液(50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl, PH=7.4)浓度为200μmol/L, 室温下慢摇孵育24h[16]。
1.2.3 交联及电泳条件将Aβ1-42加入PBS缓冲液中, 加入0.3mmol/L BS3, 冰浴交联2min, 加入1mol/L Tris, PH7.4的终止液终止, 电泳时加入5×上样缓冲液, 90℃煮5min上样。戊二醛交联, 使用0.3mmol/L或其他浓度的戊二醛, 交联1min, 加入1mol/L Tris, PH 7.4的终止液终止, 加入5×上样缓冲液, 90℃煮5min上样。银染分析选用4%浓缩胶和16.5% Tris-Tricine分离胶, 所有的West Blot实验中, 采用4%~16.5%的梯度胶进行。
1.2.4 电镜样品制备用Aβ42溶液2μL加到放电/亲水化处理的碳膜上, 孵育1 min后, 用超纯水清洗, 然后用1%(质量分数)磷钨酸钠负染1min。吸去多余液体, 将筛格在空气中干燥备用。
2 结果与分析辛二酸二琥珀酰亚胺(Disuccinimidyl suberate, DSS)是一种不溶于水的N-羟基的琥珀酰亚胺酯(NHS-ester), 如图 1A所示。双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(Bis(sulfosuccinimidyl), BS3)是DSS水溶性的形式, 当BS3溶解后, 就会讯速脱去含N部分, 从而在分子的两头与蛋白N-端的α-氨基酸或者赖氨酸发生反应, Aβ1-42具有Lysine-18和Lysine-28两个赖氨基酸与BS3产生交联, 反应可以通过1mol/L Tris, HCl或者1mol/L Glycine溶液来终止。本文采用易溶于水的BS3交联Aβ1-42蛋白, 并使用1mol/L Tris, HCl来终止交联反应。
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图 1 双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐(BS3)分子式 Fig. 1 Molecular structures of bis(sulfosuccinimidyl)(BS3) |
先前的Aβ交联报道中, 对Aβ1-40与膜作用进行了说明[10-11, 16]。本文采用0.3mmol/L, 0.6mmol/L, 1.2mmol/L 3个浓度梯度, 并采用不同的交联时间, 在冰浴条件下对Aβ42/40单体进行交联比较, 并通过同样浓度的BS3对Aβ1-42/40单体进行交联, 通过对交联剂浓度、交联时间的控制, 结果如图 2所示, 可以看出, 戊二醛即使在最低浓度(0.3mmol/L)下, 采用很短的交联时间(1min), 不管是Aβ1-40还是Aβ1-42均会被交联成寡聚体; 而使用BS3交联1min, 两种蛋白单体不会导致寡聚体形成, 时间延长至5min, 单体也会发生寡聚变化。这说明使用BS3作为交联剂只要控制交联时间在5min以内就不会导致单体的交联发生。从图 2还可以看出1.2mmol/L浓度交联更弱。
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冰浴条件下, A 使用戊二醛对Aβ1-42;B 使用戊二醛对Aβ1-40单体进行交联; C 使用BS3对Aβ1-42单体进行交联; D 使用BS3对Aβ1-40单体进行交联使用银染显色 图 2 戊二醛及BS3对Aβ1-42/40单体的交联控制 Fig. 2 Glutaraldehyde and BS3 cross-linked with Aβ1-42/40 monomer |
ADDL与原纤维是最常见的两种Aβ1-42聚集形式[16], 通过16.5%(质量分数)的Tris-tricine胶分析Aβ1-42的单体、ADDL及原纤维3种形式。在不交联的情况下, 没有明显的差别(图 3不交联的两图)。使用0.3mmol/L戊二醛交联Aβ1-42单体、ADDL及原纤维3种形式, 即使只有30s也很容易出现整体过度交联, 从而导致Aβ1-42的3种形式并没有差异(图 3 0.3mmol/L戊二醛交联所示)。使用0.3mmol/L蛋白浓度的BS3交联10min, 3种蛋白条带之间存在较大差别, 单体交联后, 出现少量3聚和4聚形式, ADDL除3聚和4聚外还出现其他5聚体和更高的寡聚形式, 原纤维经过交联后, 4聚和3聚减少, 但是明显有其他形式的聚集体存在, 还可能存在高聚未进入分离胶内, 结果如图 3所示, 0.25mmol/L BS3交联所示。
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箭头指出较大聚集体的位置。上3个图采用银染，下3个图采用Western Blot分析 图 3 交联分析Aβ1-42的3种寡聚形式 Fig. 3 Analysis of three crosslinked oligomeric forms of Aβ1-42 |
BS3能区分单体和寡聚体状态的Aβ1-42, 且3种蛋白在条带上存在明显的差异性, 单体交联后以单体、3聚、4聚3种形式出现, 与未交联的ADDL相比, ADDL的四聚体增多, 而原纤维形式的Aβ1-42, 4聚体没有增多, 却出现较大的寡聚形式, 停留在分离胶入口处。戊二醛很容易导致Aβ1-42“过度”交联, 从而难以比较Aβ1-42 3种形式的差别。
2.3 电镜分析戊二醛、BS3对Aβ1-42的交联情况使用透射电镜(TEM)观察Aβ1-42的单体、ADDL及原纤维三种形式的交联情况如图 4, 分别是未交联、0.3mmol/L戊二醛及BS3交联过的Aβ1-42样品, Aβ1-42单体直径仅为1nm, 电镜很难观察到, 但戊二醛交联后的Aβ1-42出现寡聚。由图 4可以看出, BS3交联以后, 蛋白有明显的聚集, 而戊二醛的交联明显要严重, 即BS3对Aβ1-42的交联很“温和”, 与上述电泳结果相符合。
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A Aβ1-42单体; B Aβ1-42制备的ADDL; C Aβ1-42制备的原纤维; D Aβ1-42单体BS3交联; E ADDL BS3交联; F 原纤维BS3交联; G Aβ1-42单体戊二醛交联; H ADDL戊二醛交联; F 原纤维戊二醛交联 图 4 3种状态的Aβ1-42使用戊二醛及BS3交联的电镜图电镜照片标尺为50nm Fig. 4 Analysis of three crosslinked oligomeric forms of Aβ1-42 by Transmission electron microscopy (TEM) |
综合以上电泳和电镜结果, 可以发现BS3对Aβ1-42的电泳电镜分析均能起到固定状态的效果, 其作用主要有以下几个方面:①BS3适度交联, 可以在Tris-Tricine电泳中识别出Aβ1-42单体、ADDL及原纤维等形态; ②相对于戊二醛的交联, BS3显得更合适, 不会导致过度交联寡聚物的产生; ③BS3交联后使用电泳分析, 可以得到与电镜相支持的结果。
3 讨论可溶性Aβ寡聚体在AD的病源学过程中起着很重要的作用。2003年JBC曾专门报道如何控制Aβ蛋白的单体和寡聚体状态[14], 这成为Aβ1-42单体处理的标准方法。人们还对除Aβ以外的一些易聚集蛋白进行寡聚检测, 如α-突触核蛋白, IAPP等[11, 17], 以显示它们可能存在共同的毒性机制。本文选用最常用的两种常见寡聚体ADDL和protofibril进行实验。
戊二醛作为交联剂曾被报道, 然而在Aβ状态分析的实验中, 发现戊二醛容易过度交联, 即使很低的交联剂浓度和很短的交联时间, 单体状态的蛋白也会产生严重聚集, 这就不能达到分析Aβ状态的目的, BS3对蛋白的交联相对“温和”, 不容易对Aβ1-42单体产生过度交联, 结果如图 2, 3所示。BS3提高到1.2mmol/L, 结果却并没有0.3mmol/L浓度明显, 这是因为1.2mmol/L交联剂加入后, 形成大的聚集体可能并未进入胶内, 此外在染色过程中, 整块丙烯酰胺胶处在培养皿中作旋转摇动, 中间部分具有一定的银染优势.而边沿条带染料容易被洗脱。
总之, 在Aβ1-42等易聚蛋白状态检测过程中, 使用BS3交联可以显示出蛋白条带的特异性, 从而达到区分Aβ不同聚集形式的目的, 在Aβ与AD的毒性机制研究中, 使用BS3交联的手段可以起到很好的帮助作用。
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