2003年6月，西安市文物保护考古所(现名为：西安市文物保护考古研究院)在西安市北郊文景路中段枣园工地发掘清理了一座西汉早期偏晚大型长斜坡竖穴土圹墓^[1]，在其中一件大型凤鸟纹青铜锺中发现了重约为26公斤的西汉古酒(见图 1)，这是迄今发现保存最好、存量最多的古酒^[2]。

出土后的西汉古酒及沉淀物经过提取，分别存放在11个经过密封处理的试剂瓶里，放置在冷藏柜中于0~4℃低温保存。2012年底在其中一个试剂瓶内发现有漂浮的霉菌状异物(见图 1)，为明确污染物的微生物种类，本文应用16S r DNA/18S r DNA序列分析技术手段研究了古酒中的污染微生物真菌以及细菌种类，查明了造成污染的原因以制定科学的保护措施，为出土古酒保护与长期保存提供可靠经验。

分子生物学技术在欧洲文物保护研究领域应用较为普遍^[3-11]。该方法在我国文物保护领域的应用起步较晚，2010年前、后逐渐有分子生物学在文物保护领域应用的文献报道^[12-19]。本研究则是首次使用16S rDNA/18S rDNA序列研究酒这一类液体文物中滋生出的菌害种类和来源。

1 材料与方法 1.1 实验材料

材料：真菌PDA固体培养基和细菌LB固体培养基高压灭菌后备用；基因组提取试剂盒购自Omega公司(E.Z.N.A Soil DNA Kit)；Taq DNA聚合酶、缓冲液体系、引物定制均由Invitrogen公司提供。

设备：微型离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)、超低温冰箱(日本三洋电机株式会社)、全自动高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司)、PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、恒温培养箱(上海精诚分析仪器制造有限公司)、凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司)等。

1.2 实验方法 1.2.1 样品采集

在无菌操作台中，在灼烧的酒精灯下使用灭菌完全的药匙挑取古酒上层悬浮物放入灭菌离心管中，放入-4℃冰箱中保存待用。

1.2.2 菌种分离及形态观察

在无菌操作条件下，用接种环挑取绿色悬浮物分别在PDA培养基和LB培养基上划线培养，并分别置于28℃和37℃恒温培养箱中倒置培养3天；观察生长菌落挑取形态明显，颜色不同的菌落接种于另一新培养基上进行纯化培养，重复纯化3次直到培养出纯化单菌落，观察记录并保存。

1.2.3 基因组DNA提取

将纯化的菌株根据基因组DNA提取试剂盒提供的提取说明，抽提DNA并验证。

1.2.4 PCR扩增及测序

真菌引物序列ITS1：5′- TCCGTAGGTGAACCT-3′，ITS4：5′- TCCTCCGCT TATTGATATGC -3′。细菌引物：7F：5′-CAGAGTTTGATAATGGCT-3′，1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA -3′。PCR反应体系为25μL，其中模板量为1μL(20ng/μL)，10 × PCR Buffer 2.5μL，10m mol/L dNTP 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，引物F(10μmol/L)0.5μL，R(10μmol/L)0.5μL，加无菌双蒸水至25μL。PCR循环条件为94℃预变性4 min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃终止反应。PCR扩增完毕，产物用1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.5 序列比对及系统发育树的构建

得到测序结果后，将菌株的基因序列输入GenBank中进行同源序列搜索(BLAST search)，并下载相关类群微生物菌株序列，利用Clustal X软件分别对菌株与模式菌株的序列进行比对，然后采用MEGA5.0软件进行多重序列比对，并构建Neighbor-Joining分子系统进化树。

2 结果与讨论 2.1 菌种的分离纯化与形态观察

经分离纯化，从古酒悬浮物中得到4株不同形态的菌种。从菌落形态及生长条件上分析得出一种微生物为真菌，编号IS456；3种为细菌，编号分别为S2366，S2367和S2368。

真菌IS456(图 2-A)平板培养菌落较大，圆形，隆起，较致密；分生孢子呈淡黄色，单细胞，平滑链状，无色至黄色，孢子梗末端膨大。细菌S2366(图 2-B)菌落形态呈球状，凸起，边缘整齐，呈黄色，无芽孢，无荚膜。细菌S2367(图 2-C)菌落光滑，呈球形微凸起，边缘整齐，成簇出现；细菌S2368(图 2-D)呈球形，葡萄状排列，无鞭毛，无芽胞。

2.2 分子生物学鉴定结果

将4个菌种的DNA测序序列与Genbank中已知序列比对(见表 1)并构建Neighbor-Joining分子系统进化树(图 3~6)。结果表明，真菌IS456与淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)的相似度在99%以上，确定该菌为淡紫拟青霉菌，该菌属于半知菌亚门(Deuteromyeotina)、丝孢纲(HypHomyeetes)、丝孢目(HypHomycetales)、丛梗孢科(Monilaeeae)、拟青霉属(Paecilomyces)真菌。

3株细菌S2366，S2367，S2368的同源性比对显示，这3种菌分别与考克氏菌属细菌(Kocuria)、微球菌(Micrococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus)的相似度在99%，亲缘关系最近。因此，判定这3种细菌分别为考克氏菌属细菌、微球菌和葡萄球菌。

2.3 微生物成因

本次古酒种菌害成分鉴定出了4种优势菌种，其中真菌为紫拟青霉菌，3种细菌分别为微球菌、考克氏菌属细菌和葡萄球菌。城市不同环境中的空气污染物的研究报道表明，微球菌属、考克氏菌、葡萄球菌都属于空气微生物的优势菌种^[20-21]；针对西安地区^[22]，微球菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌属、假单抱菌属是西安地区空气中的优势细菌；青霉属、拟青霉属、枝抱菌属和无抱菌属于空气真菌的优势菌种。古酒中的优势菌种与西安空气中微生物的常见菌种一致，可以推测霉菌应来源于外界空气的介入。

西汉古酒自2003年考古发现以来，一直存放于密闭的试剂瓶中，于0~4℃的低温环境中存放近10年，未发现任何微生物富集。直至2012年才在试剂瓶中发现漂浮的微生物，此时的密封材料已经老化并出现脱落。推测由于与外界的空气交换，给古酒中带来了霉菌，古酒中丰富的有机质为微生物生长提供了所需的养分，因而造成古酒中微生物萌发与富集，蔓延成菌斑。

2.4 防治对策

微生物在古酒中的萌发与富集，不但会以酒中的有机质为养分，不断加剧古酒成分的改变。因此，西汉古酒保护的首要任务就是要对古酒进行灭菌，由于酒类液态物质的特殊性，可以考虑结合真菌、细菌的物理属性，选用物理过滤法来除菌。

为避免密封材料老化再次产生微生物，可以使用氧气指示剂等随时监测密封情况并及时处理。根据多数微生物的特点，生长温度为5~80℃，营造低温环境，可有效抑制霉菌滋生。

3 结论

针对西安枣园西汉早期墓葬出土古酒中出现的菌害，对霉菌的种属鉴定可以准确地查明病害原因，以制定出具有针对性的科学保护措施。本实验应用形态学检测及16S r DNA/18S r DNA基因序列进行序列比对分析，获得如下结论：

1) 分析快速准确地判定出西汉古酒菌害中的真菌以及细菌种类，分别为淡紫拟青霉菌，微球菌、葡萄球菌和考克氏菌等1种真菌和3种细菌，这是16S r DNA/18S r DNA序列分析首次在液体文物菌害成份鉴定的成功应用。

2) 通过菌落成份与空气中常见菌种的比对，判定古酒中滋生微生物为外界空气交流而引入的微生物。做好酒类液体文物密闭环境的控制，将有效防止液体文物霉变的发生。通过0~4℃低温环境的控制，不但有利于与酒类液体文物的保存，还会抑制霉菌的生长。

3) 通过微生物种类及滋生原因分析，为类似液体文物病害分析提供了宝贵的经验。