2017, Vol. 47
酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor, FGF1)有着很好的促有丝分裂活性。1984年被首次报道, 且在胚胎发育、血管形成以及骨骼系统的发展过程中起着至关重要的作用[1]。FGF1应用于临床的伤口愈合和局部缺血治疗也已有近20年的历史[2-3]。最近, 有研究报道FGF1具有调节营养稳态的效果[4], 尤其是对2型糖尿病有可靠疗效。由于其广泛的应用前景, 现阶段对FGF1的需求日益增加。目前FGF1已经在大肠杆菌、酿酒酵母、哺乳动物细胞等宿主中成功表达[5-6]。其中，在大肠杆菌中获得了产量为60 mg/L的FGF27-154(FGF1的变体, 没有有丝分裂活性), 而全长活性FGF1的产量在大肠杆菌中只有3.6 mg/L[5]。最近, FGF1在毕赤酵母中也得到了表达, 其产量为108 mg/L[7], 相较于之前有了极大的提高, 但仍无法满足对FGF1的需求。
作为毕赤酵母中广泛应用的诱导型启动子[8], 醇氧化酶启动子(AOX1)在酵母生长期间被大多数碳源所抑制, 如甘油、葡萄糖或乙醇, 但可被甲醇诱导[9]。同时, 甲醛脱氢酶启动子(FLD1)在甲醇作为唯一碳源, 或甲胺作为单一氮源时会被诱导[10]，即甲醇可以同时诱导AOX1和FLD1两种启动子。已有研究证明, 两种启动子可以共存于同一个载体且互不影响蛋白表达的效率[11-13]。为了进一步提高人源FGF1的产量, 本研究构建了一个双启动子质粒, 旨在期望能够利用毕赤酵母高效表达人源FGF1, 并为FGF1的工业化生产提供一定的理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及细胞株感受态大肠杆菌DH5α购于天根生化科技有限公司; 真核表达载体pPICZαA，pPIC9K及毕赤酵母GS115购于Invitrogen公司; 从NCBI数据库(GenBank:BC032697.1)获得人FGF1的cDNA, 并由上海生工生物工程有限公司将其合成到PUC18质粒上。小鼠成纤维细胞L929购于ATCC(American Type Culture Collection)公司。
1.1.2 试剂胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Solarbio公司和天根生化科技有限公司; 限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及其他DNA工具酶购于TaKaRa公司; 其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 重组表达载体的构建提取酵母基因组作为模板, 采用特定的引物和PCR程序扩增FLD1(GenBank: KJ755994.1)的基因序列并添加酶切位点BglⅡ，HindⅢ, 双切后连接到pPICZαA质粒上组成pFZα质粒。用特定引物将FGF1基因从PUC18质粒上扩增得到, 并引入XhoⅠ和NotⅠ位点, 双切后连入pFZα载体组成pFZα-FGF1载体。将FGF1基因用另一套引物扩增并在两端引入EcoRⅠ和NotⅠ位点, 双切后连接到pPIC9K得到pPIC9K-FGF1质粒。最后, 采用特异性引物从pFZα-FGF1扩增得到其编码框并在两端加上SgrAⅠ和SphⅠ位点, 双切后连接到pPIC9K-FGF1载体内, 得到所需的双启动子质粒pPIC9K-FGF1-PFLD1-FGF1, 并简称为pPIC9K-F。将反应连接产物转入到感受态大肠杆菌DH5α细胞中, 筛选阳性菌株, 提取质粒, 酶切验证后进行质粒测序鉴定。实验过程中所有用到的引物序列见表 1, 每个引物内的酶切位点由下划线标出。
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表 1 PCR过程所用引物 Tab. 1 List of primes used in PCR process |
利用电转仪ECM 630(BTX公司, 美国)将10 μL经过SalⅠ线性化处理的重组质粒pPIC9K-F转入到100 μL制备好的感受态酵母细胞GS115中, 冰上预冷5min立即进行电转。pPIC9K-FGF1质粒作为对照也进行了电转。具体电转条件为1.5 kV，50 μF，200 Ω。电转结束后立即加入1 mL冰浴的1.0 mol/L山梨醇, 在30℃条件下孵育1 h; 然后吸取100 μL菌液在MD平板(含1.34% YNB, 2%葡萄糖, 4×10-5%生物素，质量分数)上涂匀, 将MD平板上长出的转化株分别转移到到含有0.5，4.0 mg/mL G418抗性的YPD平板上, 30 ℃条件下培养3天, 筛选含有高拷贝的阳性转化株。
1.2.3 FGF1的摇瓶表达挑取高拷贝单菌落接种于5 mL的YPD培养基中, 220r/min，28℃培养24 h。将培养液离心, 去除上清, 将菌体转移至25 mL BMGY培养基中, 28℃，220r/min培养。当细胞OD600达到2~8时, 收集菌体, 将菌体重悬稀释至OD600为1.0并转移至BMMY培养基进行蛋白的诱导表达。每隔24 h进行取样, 并向BMMY培养液中添加0.1%(体积分数)的甲醇。将收集的样品在室温下12 000r/min离心3 min, 收集上清液并通过SDS-PAGE方法检测FGF1表达水平。
1.2.4 SDS-PAGE与LC-MS/MS分析电泳所采用的分离胶浓度为12%(质量分数), 染色液为考马斯亮蓝R-250(Solarbio公司)。上样过程中每孔上样量为10 μL, 蛋白纯度和浓度均由Quantity One软件进行分析。使用液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)来鉴定所得产物。将SDS-PAGE凝胶上目标蛋白对应的条带切下, 送至北京华达蛋白研究开发中心进行LC-MS/MS分析, 鉴定结果与UniProt数据库中的标准数据(UniProtKB-P05230)进行比对。
1.2.5 FGF1的上罐发酵使用30L发酵罐(Bioengineering公司, 瑞典)进行FGF1的大规模诱导表达。挑取单菌落于BMGY中培养2天, 按5%(体积分数)的接种体积接种到含有基础甘油培养基的发酵罐内。初始甘油在大约24h后消耗完全, 持续8h以100 mL/h的速率补入70%(体积分数)的甘油以增加生物量。搅拌速度在这个阶段逐渐增加到700r/min。补料停止1h后, 向培养物中流加甲醇来诱导产生FGF1, 同时监测溶解氧水平并将其始终维持在30%左右。整个发酵过程中, 温度和pH值分别维持在28℃和5.0[14-15]。每6h取样监测诱导阶段培养基中的细胞生长(OD600)情况和蛋白表达水平, 诱导持续约24h后放罐。
1.2.6 目的蛋白的纯化发酵液首先在8 000mol/L，4℃的条件下离心20min, 对上清液进行超滤处理, 浓缩蛋白并除去部分杂质。然后用10 mmol/L磷酸缓冲液(PBS)将超滤液稀释至盐浓度达到20 mmol/L, 分批上样到Superdex 75(GE, 美国)分子筛柱中。利用AKTA系统(GE, 美国)控制流速为5 mL/min。上样完成后用相同盐浓度的PBS缓冲液充分洗涤层析柱。当215nm处的UV吸收峰开始增加时收集目的蛋白, 至吸光度下降时终止。
1.2.7 目的蛋白的生物活性测定利用L929细胞(小鼠成纤维细胞)对重组FGF1进行生物活性测定, 研究其是否对细胞增殖具有刺激作用。将纯化的蛋白溶解于细胞专用培养基中, 过滤除菌, 配制成1 mg/mL的标准浸提液, 随后稀释至5 μg/mL备用。同时，设置阳性对照组与阴性对照组, 阳性对照浸提液含有相同浓度的大肠杆菌重组FGF1(普欣生物, 上海), 阴性对照为无蛋白添加的培养液。L929细胞在96孔板中按照1×104个/孔进行培养, 培养温度为37℃, 并提供5%(质量分数)的CO2。孵育24h后, 用样品及对照的浸提液替换孔内培养基, 并孵育24, 72, 120h。然后吸除培养液, 加入50 μL的5 mg/mL MTT和100 μL新鲜培养基, 继续培养4h, 加入100 μL的DMSO作为溶剂。使用酶标仪(Bio-Rad, 美国)在490 nm处测量每个孔内培养物的OD值。相对细胞生长速率可由下式计算:
相对细胞生长率=(OD/OD阴性对照)×100%。
2 结果与分析 2.1 重组质粒的构建与转化如图 1所示, 本研究成功构建了双启动子载体pPIC9K-FGF1-PFLD1-FGF1, 简称为pPIC9K-F。其中, 2个诱导型启动子分别控制2个独立且互不干扰的编码框。第1个编码框由AOX1, α信号肽序列和FGF1基因组成, 而第2个包含FLD1, α信号肽序列和FGF1基因。图 1中S表示信号肽, TT表示转录终止子。每个编码框的末端都有其自身的终止子序列。菌落PCR和质粒测序鉴定表明构建的质粒序列与本设计完全一致。将重组载体线性化, 并连同pPIC9K-FGF1作为对照成功转入到GS115细胞中, 并选取高拷贝菌株进行后续的蛋白表达。
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图 1 质粒构建示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the recombinant vector construction |
在目标菌株和对照组中分别选择1个高拷贝菌株在摇瓶中诱导表达, 将其中整合有目的载体的菌株命名为1#, 含有质粒pPIC9K-FGF1的对照菌株为2#。在这个阶段, 从以下3种情况对比FGF1的产量:用甲胺诱导1#菌株(即FLD1启动子被诱导), 用甲醇诱导2#菌株(即AOX1启动子被诱导)和用甲醇诱导1#菌株(AOX1和FLD1共同作用)。图 2显示了在摇瓶中诱导的每种样品的培养基上清液中蛋白质的SDS-PAGE分析。其结果表明两个启动子在毕赤酵母中均成功诱导蛋白表达。重组FGF1分子量约为17 kDa, 与理论值(17.4 kDa)基本一致。通过Quantity One灰度扫描软件检测FGF1的浓度, 并利用双缩脲法来检验。仅诱导FLD1启动子表达的FGF1产量为1.36 mg/L, 低于诱导AOX1启动子所得的1.88 mg/L。甲醇同时诱导两个启动子作用时产量达到3.17 mg/L, 产量明显提高。与含有相同抗性的pPIC9K-FGF1的转化体相比, 转化双启动子质粒的菌株具有双倍的基因拷贝数。
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图 2 FGF1的摇瓶表达 Fig. 2 SDS analysis of shake flask culture |
选择1#菌株在甲醇诱导下进行上罐发酵。如图 3(A)所示, FGF1的产量随时间增加。诱导后每隔6h通过SDS-PAGE检测分泌产物, 其产量用Quantity One软件进行估算。图 3(B)显示, 诱导24h后产量达到最高, 然后趋于稳定。最终FGF1的产量成功地提高到约200 mg/L, 约为之前报道的全长人FGF1的最高产量的两倍。同时, 本研究中使用的分泌型表达系统在后续的纯化过程中比先前使用的胞内表达更加经济实用。
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图 3 FGF1在发酵过程中的SDS分析 Fig. 3 SDS analysis of FGF1 produced in fermentator |
为了鉴定表达得到的重组产物是否准确, 采用LC-MS/MS进行蛋白定性分析。鉴定结果与UniProt中的标准数据(UniProtKB-P05230)进行对比发现, 重组产物的序列覆盖率约为85%, 证实所获得的蛋白质是人FGF1。此外, 图 4显示, FGF1的理论分子量为17 kDa, pI为6.89, 均与标准资料相符。
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图 4 FGF1的LC-MS/MS鉴定 Fig. 4 Identification of FGF1 by LC-MS/MS |
由于目标蛋白和发酵上清液中的其他分泌蛋白在分子量上有显著差异, 选择凝胶过滤层析作为分离蛋白质的主要步骤, 同时还起到脱盐的功效。图 5所示的是FGF1的洗脱曲线, 显示了通过凝胶过滤色谱进行的纯化过程。Superdex 75色谱柱在该过程中表现出了良好的性能。其中，红色与棕色的曲线分别代表蛋白峰和盐峰。纯化后得到的FGF1在SDS-PAGE上显示单条带, 表示纯化成功, 软件分析其纯度达到97%，在纯化后通过双缩脲法测定的最终产率为197 mg/L, 约为之前报道的最高产量的2倍。由于纯化程序简便, 目标蛋白的回收率高达95%。
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图 5 凝胶过滤层析示意图 Fig. 5 The result of gel filtration chromatography |
为了证实本研究中产生的重组人FGF1是有活性的, 利用L929细胞研究其促有丝分裂性能。如图 6所示, 重组FGF1培养的细胞与阳性对照(含大肠杆菌生产的FGF1)培养的细胞相对生长率基本相同。与阴性对照相比, 两种样品在整个过程中均有效促进了细胞的生长。这种现象表明, 毕赤酵母中产生的FGF1具有良好的生物相容性。
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图 6 FGF1的生物测定结果 Fig. 6 Bioassay results of FGF1 |
本研究利用含有醇氧化酶启动子(AOX1)和甲醛脱氢酶启动子(FLD1)的双启动子质粒pPIC9K-FGF1-PFLD1-FGF1成功提高了人FGF1的产量。摇瓶培养过程表明两个启动子均被有效诱导。SDS-PAGE和LC-MS/MS分析结果显示所得产物与天然FGF1一致。经过发酵和纯化, 其产量可达197 mg/L, 约为之前报道的最高产量的两倍。生物活性测定实验表明，该产品具有良好的生物相容性。综上所述, 双启动子表达的方法可适用于高效生产FGF1。通过进一步改善及优化, 本研究所构建的双启动子表达体系可广泛应用于外源蛋白在毕赤酵母中的工业化生产。
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