渭南师范学院学报 2016, Vol. 31 Issue (12): 88-92  
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引用本文

刘嘉敏, 任彤, 王佳, 徐承, 贾安琴. 小鼠肝癌合并肝纤维化模型的构建——四氯化碳和二乙基亚硝胺诱导[J]. 渭南师范学院学报, 2016, 31(12): 88-92.
LIU Jia-min, REN Tong, WANG Jia, XU Cheng, JIA An-qin. Establishing a Mice Model Fhepatic Fibrosis Induced by the CCL4 and DEN[J]. Journal of Weinan Normal University, 2016, 31(12): 88-92.

基金项目

国家级大学生创新创业训练计划项目:肝纤维化模型形成机制的探索研究——以四氯化碳和二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌为例（201410723016）

作者简介

刘嘉敏(1993-),女,河北无极人,渭南师范学院化学与环境学院2011级本科生

文章历史

收稿日期：2015-12-23
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小鼠肝癌合并肝纤维化模型的构建——四氯化碳和二乙基亚硝胺诱导
刘嘉敏 , 任彤 , 王佳 , 徐承 , 贾安琴     
渭南师范学院 化学与环境学院，陕西 渭南 714099
收稿日期：2015-12-23
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目:肝纤维化模型形成机制的探索研究——以四氯化碳和二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌为例（201410723016）
作者简介：刘嘉敏(1993-),女,河北无极人,渭南师范学院化学与环境学院2011级本科生
摘要: 研究四氯化碳联合二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌合并肝纤维化模型的建立。选小鼠24只，随机分为对照组与实验组。实验组每周两次腹腔注射15%的CCl4/花生油溶液，同时自由饮用1‰的二乙基亚硝胺（DEN）连续进行8周。对照组注射花生油，饮用蒸馏水。于处理后第3、6、8周处死实验组及对照组小鼠各4只，对其肝脏组织进行常规固定、包埋、切片、HE染色，观察肝脏的形态及变化。对照组与实验组小鼠体重差异显著（P<0.05），四氯化碳和二乙基亚硝胺能显著改变肝脏形态，使肝脏胶原纤维明显增生，肝星状细胞数量增加，细胞变长并分泌胶原，最终导致肝癌的形成。CCl4联合DEN诱导可成功建立小鼠肝癌并合并肝纤维化的模型。
关键词: 四氯化碳    二乙基亚硝胺    肝脏    
Establishing a Mice Model Fhepatic Fibrosis Induced by the CCL4 and DEN
LIU Jia-min, REN Tong, WANG Jia, XU Cheng, JIA An-qin     
School of Chemistry and Environment，Weinan Normal University，Weinan 714099，China
Abstract: The mice is taken as research materials to study the liver cancer and liver fibrosis in them when they were injected CCl4 and DEN at the same time. Kunming mouse were randomly divided into two groups. The experimental groups were injected by 15% CCl4/peanut oil solution intraperitoneally two times a week for eight weeks, meanwhile, drinking 1‰ DEN water solution freely. The control group was injected peanutoil, drinking purified water. Both experimental group and control group were killed at the 3, 6 and 8 weeks respectively and were stained by HE dyeing, to observe the changes of liver structure and the number of sperm. The results show that the CCl4 and DEN can significantly change the liver morphology. In the end, the liver collagen fiber was obviously proliferated, the amount of hepatic stellate cells were increased, and cells became longer and secreted collagen, which led the liver to become fibrosis and eventually caused the formation of liver cancer. The results showed that the CCl4 and DEN can significantly change the liver morphology.
Key words: carbon tetrachloride (CCl4)    diethylnitrosamine (DEN)    liver    
0、引言

四氯化碳(CCl4)是一种无色澄清透明油状液体, 具芳香性, 易挥发, 是典型的肝脏毒物, 摄入、吸入或经皮肤吸收可能致死, 接触可引起肝、肾损害。[1]低浓度长期接触则主要表现肝、肾受累,较小剂量的长期暴露也可能增加肝癌风险, 通常以CCl4来建立肝纤维化的模型。二乙基亚硝胺(DEN)是一种黄色透明的液体, 具有极强的刺激气味, 摄入、吸入或经皮肤吸收可能致死, 接触可引起肝、肾损害, 较小剂量的长期暴露也可能增加肝癌风险。低浓度的DEN可建立稳定的肝硬化小鼠模型[2], 其过程与人肝硬化的发生过程相似, 且其肝硬化发生率高, 死亡率低, 实验重复性好, 便于进行药物干预和疗效分析。刘东璞[3]等人研究采用CCl4诱导肝纤维化模型的建立, 匡志鹏采用二乙基亚硝胺、CCl4、乙醇联合诱导了小鼠肝癌, 中间经历肝炎、肝硬化阶段, 建立了较为理想的动物肝癌模型。而CCl4联合DEN这两种物质都是诱导肝癌的重要物质, 是制造肝损伤及研究肝纤维化的有利模型。故将二者结合进行诱导, 具有高转移率、高存活率、高浸润率等特点, 且周期短、易行、简便、成功率高。

1、材料与方法 (1.1) 实验材料 1.1.1. 实验动物

雄性小白鼠24只(购于第四军医大学), 体重为20～25 g, 实验室饲养并观察其生理形态特征。

1.1.2. 实验试剂

四氯化碳(购于比特博公司)、二乙基亚硝胺(购于sigma公司)、NaCl、10%福尔马林溶液、乙醇、二甲苯、石蜡、三氯化铁、酸性品红、甘油、蒸馏水、苏木素、盐酸、苦味酸饱和溶液、盐酸乙醇、伊红、中性树胶等。

1.1.3. 实验器材

光学显微镜、生物组织切片机、移液枪、1mL注射针管、电子分析天平、切片刀、石蜡(熔点56℃～58℃)、照相机、天平、恒温培养箱。

(1.2) 实验方法 1.2.1. 实验分组

雄性鼠24只, 实验前先观察一周, 后随机分为对照组和实验组2组, 每组12只, 将这两组同条件分笼饲养。

1.2.2. 操作方法(模型的建立)

在无菌操作台上, 于每周两次对实验组小鼠进行腹腔注射15%的CCl4花生油溶液(CCl4:花生油为3:7) , 每只小鼠每次剂量为0.2 mL, 同时每天用1‰DEN溶液(纯净水配制而成)喂养小鼠。对照组注射花生油溶液, 剂量与实验组相同, 同时用蒸馏水喂养。

1.2.3. 活体观察

观察小鼠的食量及饮水情况, 每周称量小鼠的体重且观察其行为, 并作记录。

1.2.4. 解剖形态观察与组织切片染色

在实验第3、6、8周分别麻醉处死每组小鼠中的4只并解剖, 之后观察小鼠的肝脏形态。用生理盐水反复洗涤肝脏组织以除去残留的血液, 迅速剪碎然后用10%福尔马林溶液对组织固定1～2天, 并进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋, 石蜡包埋后切成6 μm厚的切片；切片后再进一步经过脱蜡、复水、HE染色等, 树胶封片后于显微镜下进行观察。

1.2.5. 用Van Gieson(V.G)染色法检测小鼠组织中的胶原纤维细胞

将切片脱蜡至水, 用Weigert氏苏木素染20 min, 进行水洗, 流水冲洗10 min, 用Van Gieson氏染液1 min, 用95%酒精快速分化, 无水酒精脱水, 二甲苯透明, 封片观察。

1.2.6. 统计学分析

数据用3个独立样本的平均值±标准差(Mean±SD)来表示, 结果用双样本方差t检验来分析不同组之间的差异显著性, 显著水平定为P＜0.05。所有结果通过EXCEL统计学软件来完成。

2、结果 (2.1) 小鼠体重变化

从注射药物第3周开始实验组小鼠食量明显减少, 饮水减少, 体重增加程度明显小于对照组, 于第6周表现显著差异, 第8周表现极显著差异。实验组小鼠体重增长缓慢, 甚至有些小鼠体重有下降现象, 对照组小鼠体重增加幅度快, 体重一直在上升(如图 1所示)。

图 1 小鼠平均体重的变化
(2.2) 肝脏大体形态观察

解剖小鼠后观察, 对照组小鼠肝脏表面光滑, 而实验组肝脏表面充血颜色晦暗局部有肿瘤块, 随着时间的推移愈加粗糙, 并有肿瘤发生(如图 2所示)。

图 2 肝脏大体形态观察
(2.3) 小鼠肝脏系数的测定

小鼠经脱颈椎方法处死后, 解剖并暴露出完整的肝脏, 在天平上称量全肝脏的湿质量, 按下列公式计算肝脏系数：肝脏指数=脏器重量/体重×100(见表 1) 。

表 1 CCl4联合DEN处理对小鼠体重与肝脏系数的影响

数据用平均值 ± 标准差表示, P表示t检验结果的可信度, 显著性与极显著性水平定为P＜0.05、P＜0.01。

(2.4) HE染色观察肝脏组织结构

在显微镜下观察发现, 对照组小鼠肝小叶结构清晰(图 3A), 大多肝细胞为多核, 肝板呈索状；经药物处理过的小鼠肝组织中可见：第3周(图 3B)病变组织较少, 第6周(图 3C)病变组织逐渐变多, 第8周(图 3D)病变肝组织面积大, 排列混乱不清晰, 正常的肝小叶结构破坏, 形成假小叶[2]。

图 3 CCl4联合DEN处理不同时间肝脏组织形态观察(放大倍数：400 x)
(2.5) V.G染色法检测肝脏组织中的胶原纤维

在显微镜中观察得知, 经四氯化碳和二乙基亚硝胺处理的肝脏组织块内聚集的胶原纤维大量增多, 肝星状细胞数量增多并且呈纤维化(如图 4所示)。

图 4 CCl4联合DEN处理后肝脏组织胶原纤维观察(放大倍数：400 x)
3、讨论

我国是病毒性肝炎高发区, 肝硬化的发病率呈上升趋势,肝损伤的最初表现是发生纤维化, 肝纤维化是许多肝脏疾病的中间发展环节[4-5], 最终会发展为肝硬化至肝癌, 严重危害人类健康。因此, 抑制肝纤维化的发生发展, 对治疗各种肝病具有极为重要的临床意义。

肝纤维化是在损伤因子(如病毒、黄曲霉素、代谢病和酒精等)存在下, 肝细胞持续性受损、变性、坏死并导致炎性反应, 在炎性环境中产生的氧自由基等诱变物质引起肝细胞损伤, 损伤的肝细胞应答旁分泌细胞因子的刺激而增殖, 这种不断损伤、再生诱发的多基因变异是导致肝细胞癌变的关键。

在类似肝癌模型中,尽管CCl4在诱发肝癌的过程中亦可以出现很明显也很典型的肝硬化,但是出现的肝癌种类复杂,诱癌周期长。[6]本研究采用CCl4联合DEN诱导小鼠肝癌合并纤维化, 周期短、易行、简便、成功率高, 是一种研究人体肝癌的理想模型。

实验结果表明, 未经药物处理的小鼠肝小叶结构清晰, 大多肝细胞为多核, 肝细胞呈条索状[7], 经药物处理过的小鼠在HE染色中可见肝组织病变区域多, 面积大, 正常肝小叶结构破坏, 形成假小叶。用V.G法观察得知, 未经药物处理的小鼠胶原纤维数量少, 多分布在血细胞周围, 间质细胞如肝星状细胞数量少细胞个体体积小, 经药物处理的小鼠细胞胶原纤维数量增多, 大多发生在病变组织内, 表明本研究成功构建了肝纤维化小鼠肝癌并合并纤维化模型。

本实验通过对小鼠腹腔注射15%四氯化碳联合饮用1‰二乙基亚硝胺溶液使小鼠染毒, 实验成功地建立了小鼠肝癌并合并纤维化模型, 为后续实验做了铺垫, 也为深入研究治疗肝癌的机理提供了动物模型。

参考文献
[1] 孔娜, 匡志鹏, 杨帆, 等. Axin-1在C57BL/6J小鼠肝癌模型发生过程中的表达及意义[J]. 中国癌症防治杂志, 2014(1): 7–11.
[2] 苏普·吐尔逊, 哈木拉提, 阿不都卡德尔·库尔班, 等. 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝硬化模型的建立及病理学研究[J]. 新疆医科大学学报, 2011(3): 261–264.
[3] 刘东璞, 卢凤美, 张辉, 等. 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型的建立[J]. 黑龙江医药科学, 2009, 32(4): 14–15.
[4] 李亚琳. 气体甲醛吸入对小鼠肝组织的毒性作用[J]. 家庭心理医生, 2014(2): 11–13.
[5] 吕鹏. 四氯化碳腹腔注射制备肝纤维化模型的实验研究[J]. 胃肠病学和肝病杂志, 2003, 12(4): 339–340.
[6] 周峥珍, 章宗籍, 钱忠义, 等. DEN诱发大鼠肝癌模型的实验病理研究[J]. 昆明医学院学报, 2005(3): 15–19.
[7] 刘东璞, 赵振富, 卢凤美, 等. 复方红景天防治肝纤维化的实验研究[J]. 解剖学研究, 2008(5): 340–343.