超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)技术介导基因转染，促进血管新生，为心肌梗死的治疗提供了新的方向^[1]。然而在实际应用中发现其体内转染效率不甚理想，限制了该技术的发展。普通微泡的载基因能力及靶向性差是导致UTMD疗效不佳的重要原因^[2]。因此，本研究拟通过制备阳离子靶向微泡来提高微泡的载基因能力和靶向性，从而提高UTMD的体内转染效率，改善疗效。

二硬酯酰磷脂酸胆碱(DSPC，德国Sigma公司)，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙胺(DSPE-PEG2000，美国Avanti公司)，磷脂酰磷脂酸(DPPA，瑞士Sanofi Genzyme公司)，3β-[N-(N′, N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol，美国Avanti公司)，生物素标记的细胞间黏附分子(ICAM)-1抗体(北京博奥森公司)，鼠抗兔血管生成素(Ang-1)抗体(北京博奥森公司)，FITC-标记的IgG二抗(美国Abcam公司)，亲和素(德国Sigma公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，Zetasizer Nano S颗粒粒径及电位检测仪(英国Malvern公司)，Philips iE33超声诊断仪(美国Philips公司)，新西兰大耳兔(武汉生物制品研究所)。

将DSPC, DSPE-PEG2000, DPPA和DC-Chol按照(39:1:40:20)的摩尔比混合，置于25 ml的烧杯中，加入适量氯仿充分溶解。将溶液转入50 ml圆底烧瓶后，50 ℃减压蒸发45 min去除三氯甲烷后可见薄膜形成，加入定比例的甘油及PBS混合液，数分钟后将薄膜移出，形成混悬液。将混悬液分装至容积为1.5 ml的特制管形瓶中，经三通管充入全氟丙烷置换瓶内空气，密封瓶盖，置水浴箱42 ℃，水浴45 min，振荡50 s，即可获得普通阳离子微泡混悬液(Cationic Microbubbles, CMB)。同法，用DSPE-PEG2000-Biotin替换DSPE-PEG2000制备生物素化的阳离子微泡，取1.2 ml阳离子微泡(约8.0×10⁸ microbubbles/ml)及240 μg链霉亲和素加入2 ml EP管中轻轻摇匀，4 ℃孵育30 min，400 g×4 min离心，弃下清液，PBS漂洗离心2次，去除过量的链霉亲和素。加入80 μg生物素化的ICAM-1抗体，轻轻摇匀，4 ℃孵育30 min，400 g×4 min离心，弃下清液，PBS漂洗离心，去除过量的ICAM-1抗体，即得到携ICAM-1抗体的靶向阳离子微泡(ICAM-1 targeted CMB, TCMB)。Zetasizer Nano S颗粒粒度及电位检测仪检测微泡的粒径及表面电位，显微镜观察微泡的形态。为了验证ICAM-1抗体成功与微泡连接，将FITC-标记的IgG二抗与靶向微泡孵育，洗涤，荧光显微镜下观察微泡与抗体连接情况。

Ang-1在血管内皮细胞增殖和血管形成中扮演重要角色，是促进血管新生的重要分子，本研究中选择Ang-1基因作为治疗基因。经RT-PCR合成Ang-1 DNA序列，限制性内切酶切开pcDNA3.1(-)质粒，在相同的酶切位点插入RT-PCR产物，用DNA连接酶连接，构建Ang-1质粒。

20 μg Ang-1质粒与1×10⁸CMB及TCMB分别轻柔混匀，室温静置15 min后，400 g×4 min离心，混悬液分为两层，上层为与质粒结合的微泡层，下层为含游离质粒的清夜层，取下清液，于260 nm条件下紫外分光光度计检测，计算下清液质粒含量，微泡载基因量=总质粒量－下清液质粒量。

新西兰大耳兔，体重2.0-2.5 kg，戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉注射进行麻醉，连接心电图。开胸暴露心脏，结扎左冠脉前降支，在结扎处垫一小PE管，打活接。结扎成功后，兔心肌逐渐变苍白，心肌运动明显减弱，心电图ST段抬高大于2 mm。持续1 h后松开结扎线，恢复冠脉血供，关闭胸腔，连续3 d注射青霉素预防感染。

建模成功后2 d，65只新西兰大耳兔随机分为3组：Control组(n=15)：耳缘静脉注射“Ang-1质粒溶液1 ml+生理盐水1 ml”配置的混悬液；CMB组(n=25):耳缘静脉注射“Ang-1质粒溶液1 ml+CMB 1 ml”配置的混悬液；TCMB组(n=25)：耳缘静脉注射“Ang-1质粒溶液1 ml+TCMB 1 ml”配置的混悬液。应用相同的超声条件进行辐照治疗：Philips iE33超声显像仪，二次谐波造影模式，探头发射及接收频率分别为1.7 MHz及3.4 MHz，深度5 cm，机械指数1.3，增益100%。经耳缘静脉注射上述混悬液30 s后，按Flash击碎微泡进行治疗，每6个心动周期击碎一次，直至心腔内微泡完全消失。

转染治疗后3 d，从各组中随机取5只兔，麻醉后处死，获取心脏标本。从梗死区取100 mg心肌组织，用Trizol Reagent处理，RT-PCR半定量检测Ang-1基因的mRNA表达，以Ang-1与内参β-actin条带荧光强度之比(Ang-1/β-actin)表示各转染组Ang-1的相对表达水平。同法从梗死区取100 mg心肌组织，提取蛋白，Western Blot分析半定量检测Ang-1蛋白的表达，以Ang-1与β-actin条带强度之比(Ang-1/β-actin)表示各转染组Ang-1蛋白的相对表达量。

基因转染治疗后4周，从各组实验动物取结扎线下心肌组织常规石蜡包埋切片后行vWF因子免疫组织化学染色。根据Weidner评判标准，高倍镜下染为棕黄色的单个内皮细胞或数个内皮细胞群作为一个血管计数，计数毛细血管最多区域的5个视野，取其平均值。

基因转染治疗后4周对每只实验动物行心肌超声造影检查，观察各组实验动物左室前壁心肌造影剂充填情况，团注造影剂第15秒时分别测量左室前壁(梗死区)及下壁(非梗死区)造影信号强度，以其比值代表各组实验动物心肌血流灌注。

分别于基因转染前及转染后4周对每只实验动物行常规二维超声及M型超声检查。采用胸骨旁左室乳头肌水平短轴观，M型超声测量左室射血分数(LVEF)。

统计学分析应用SPSS 17.0软件，计量资料以均数±标准差表示，两样本比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA分析，进一步两两比较采用Student Newman Keuls-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

CMB和TCMB的粒径分别为(2.9±1.9) μm和(3.1±2.1) μm (P>0.05)，表面电位分别为(+31.3±3.9) mV和(+22.0±2.4) mV (P < 0.01)。光镜下均表现为圆形气泡，荧光显微镜下CMB表面无荧光而TCMB周围可见明亮的绿色荧光，表明ICAM-1与微泡特异性结合，靶向微泡构建成功，见图 1。每10⁸个CMB和TCMB载基因量分别为(3.3±0.7) μg和(4.0±0.9) μg。

图 1(Figure 1)

图 1 微泡形态学检测及鉴定(标尺=10 μm)

转染治疗后3 d，RT-PCR显示3组间Ang-1 mRNA表达水平存在显著差异，TCMB组>CMB组>Control组(P < 0.05)。半定量检测结果显示TCMB组Ang-1 mRNA表达是CMB组的3.3倍，而Control组仅可见少量表达，见图 2A。Western Blot结果显示三组间Ang-1蛋白表达亦呈相同趋势，TCMB组明显高于CMB组，CMB组明显高于Control组(均P < 0.05)。TCMB组Ang-1蛋白相对表达量是CMB组2.7倍，是Control组的13.2倍，见图 2B。

图 2(Figure 2)

图 2 Ang-1基因表达 A:RT-PCR检测Ang-1基因mRNA表达；B: Western Blot检测Ang-1蛋白表达

转染治疗后28 d，vWF免疫组化染色显示3组心肌微血管密度(MVD)存在显著差异，TCMB组>CMB组> Control组(P < 0.05)，TCMB组MVD是CMB组的2.8倍，是Control组的5.5倍，见图 3A。

图 3(Figure 3)

图 3 心肌微血管密度检测(A)及超声造影检测(B)(标尺=50 μm)

心梗后2 d，心肌声学造影显示三组左室前壁均可见明显的充盈缺损，且充盈缺损程度相近(P>0.05)；转染治疗后28 d，心肌声学造影显示Control组左室前壁可见明显的充盈缺损，CMB组次之，TCMB组左室前壁充盈缺损程度最低。三组梗死区造影信号强度：TCMB组>CMB组> Control组(P < 0.05)，见图 3B。

心梗后2 d，三组兔左室射血分数(LVEF)均较心梗前显著减低(均P < 0.05)，三组间比较无显著差异(P>0.05)；与心梗后2 d相比，转染治疗后28 d，Control组LVEF进一步减低[(44±10)%]，而CMB组和TCMB组均有所改善，但以TCMB组改善更显著[(59±7)% vs (54±8)%, P < 0.05]。

基因治疗为错失血运重建治疗机会的心肌梗死患者带来了新的希望，但是目前缺乏安全高效的基因导入技术。心肌内注射安全性差，而冠脉内注射对技术要求较高、成本大，均不甚理想^[3]。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术以微泡造影剂作为治疗基因的载体，通过静脉注射载基因的微泡，待其到达心脏后，利用超声靶向击碎微泡，释放基因，与此同时微泡破裂产生空化效应，释放巨大的瞬时能量，在靶细胞表面形成可逆的微孔，使治疗基因得以进入细胞，从而实现基因转染^[4]。UTMD技术具有操作简单、安全快捷、低毒、低免疫原性等优势，很快吸引了研究者的注意力，但是目前该技术的转染效率仍不甚理想。研究表明，普通微泡的载基因能力及靶向性差是导致UTMD转染效率不佳的重要原因^[2]。基于此，本研究成功构建ICAM-1靶向阳离子微泡作为Ang-1治疗基因的载体，有针对性地解决普通微泡载基因能力及靶向性差的问题。

首先，本研究以DSPC, DSPE-PEG2000, DPPA和DC-Chol等脂质材料作为微泡膜结构的主要成分，优化的配比可以起到稳固微泡膜结构的作用。DC-Chol是第一个合成且经美国FDA认可的胆固醇衍生物类阳离子脂材，毒性较低，目前已应用于临床实验的研究^[5]。DC-Chol是使阳离子微泡表面带正电荷的主要作用物质，本研究中无论CMB还是TCMB表面均带明显的正电荷，可与带负电的质粒DNA通过静电吸附作用有效结合，明显提高了微泡的载基因能力，本研究中CMB和TCMB的载基因量都大于3 μg/10⁸微泡。研究表明阳离子微泡不仅能提高微泡的载基因能力还能保护基因免遭体内DNA酶的降解，从而增加到达靶器官的治疗基因浓度，提高转染效率^[6]。

其次，本研究用生物素-亲和素桥接法在微泡表面连接ICAM-1抗体，成功构建ICAM-1靶向阳离子微泡。研究表明，心肌缺血或梗死时，损伤的细胞释放大量的促炎介质，使冠脉内皮细胞激活，大量表达炎性黏附分子，介导白细胞的黏附反应和血小板的活化，从而加重心肌微循环障碍^[7]。ICAM-1是所有炎性黏附分子中最主要的一种^[8]，可作为微泡黏附的靶点。我们前期研究^{[9, 10]}证实，无论体外实验还是体内实验，ICAM-1靶向阳离子微泡均可与炎性血管内皮细胞特异性黏附，增加靶细胞周围载基因微泡的浓度，减少基因与靶细胞的距离，在超声空化效应作用时，可以增加治疗基因通过细胞表面微孔进入细胞的概率，从而增强转染效率。本研究结果显示，虽然连接ICAM-1抗体后使得TCMB的表面电位和载基因量略有下降，但TCMB组转染效率及心脏功能却较CMB组有明显改善，说明在保证微泡阳离子属性的前提下，增加微泡的靶向性可以提高转染效率，增强疗效。

综上，本研究成功构建ICAM-1靶向阳离子微泡作为Ang-1治疗基因的载体，有针对性地解决了普通微泡载基因能力及靶向性差的问题，能提高UTMD转染效率，改善缺血心脏的功能。