白色脂肪细胞具有内分泌功能，可分泌大量的脂肪因子(adipokines)，其数量、结构、功能等的变化将影响全身能量平衡、改变体液脂肪因子的分布与水平，与胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病、心血管疾病、肿瘤等疾病的发生、发展密切相关^[1-4]。因此，探寻控制脂肪细胞分化和脂肪因子合成与分泌的生物活性物质，研究其分子基础，在白色脂肪相关代谢紊乱的治疗模式中具有潜在的意义。

乌地那非(Udenafil)是磷酸二酯酶5型(phosphodiesterase type 5，PDE5)特异性抑制剂，被用于治疗勃起功能障碍^[5]。近年研究表明，乌地那非可改善2型糖尿病患者的勃起功能障碍^[6]，也可改善脂肪细胞的胰岛素抵抗^[7]。但迄今为止，对其调节脂肪细胞分化和脂肪因子合成与分泌的作用未见报道。本研究拟对此进行研究，并探讨其可能的机制。

3T3-L1前脂肪细胞(preadipocytes)购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1% penicillin/streptomycin(P/S)的DMEM培养基、37 ℃、5% CO₂条件下培养。

DMEM液体培养基、FBS、P/S等购自Gibco公司；PPARγ抑制剂GW9662(M6191)和油红O(O0625)购自Sigma-Aldrich公司；Udenafil(Synonyms: DA8159)购自MedChemExpress公司；各种抗体均购自Cell Signaling Technology公司；PPARγ Transcription Factor Assay Kit(ab133101)和小鼠Adiponectin ELISA Kit (ab108785)购自Abcam公司；小鼠PPARγ siRNA(MSS276435)购自Thermo Fisher Scientitic公司。

3T3-L1前脂肪细胞在100%汇合后继续生长3 d；随后，细胞在含1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)，1.67 μmol/L胰岛素和10% FBS的新鲜DMEM中孵育3 d，诱导其分化；然后，将细胞在含有0.41 μmol/L胰岛素和10% FBS的培养基中再培养3 d；最后，在生长培养基(含有10% FBS和1% P/S的DMEM)中培养4 d；此时，获得成熟的3T3-L1脂肪细胞。

脂肪细胞分化后，细胞用1×PBS洗涤，并在室温下用10%多聚甲醛固定1 h；去除多聚甲醛后，加入油红O染料染色30 min；蒸馏水洗涤平板4次，并通过奥林巴斯显微镜(日本东京)以50倍放大率观察并拍照获得细胞中脂质积聚的形态特征。为了量化脂质积聚，用异丙基洗脱染色的油滴乙醇，并在酶标仪上、490 nm处测量其吸光度值。

工作浓度为120 pmol/L的siRNA利用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂(Invitrogen公司)转染至细胞，操作按试剂说明书进行，转染效率经蛋白免疫印迹评估。

使用TRIzol试剂提取3T3-L1脂肪细胞总RNA；为分析基因表达，使用M-MLV逆转录酶从总RNA中合成cDNA；SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ完成半定量实时PCR(RT-PCR)；本研究中使用的引物如下：小鼠脂肪蛋白2(adipocyte protein 2, aP2) mRNA (forward 5′- GCGTAAATGGGGATTTGGTC-3′, reverse 5′-CTCCTGT CGTCTGCGGTGATT-3′)、小鼠β-肌动蛋白(β-actin) mRNA (forward, 5′-CCACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′, reverse 5′-CTAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′)。

分别利用PPARγ转录因子分析试剂盒和脂联素ELISA试剂盒测定，按试剂盒说明操作。

实验结束，洗涤并收集3T3-L1脂肪细胞，用含有20 mmol/L HEPES(pH 7.9)、350 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、0.5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl₂、10%甘油、1% Nonidet P-40、10 mmol/L NaF、0.1 mmol/L NaV、8 mmol/L β-甘油磷酸酯、磷酸酶抑制剂混合物Ⅰ和Ⅱ (Sigma-Aldrich公司)的裂解缓冲液裂解细胞；14 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离保留上清，BCA(bicinchonininc acid)法测定蛋白浓度，并调整蛋白浓度为2 μg/μl；加入等量的2×SDS上样缓冲液，100 ℃加热10 min，14 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离取上清用于SDS-PAGE胶分离蛋白，转移蛋白到硝化纤维素膜，并用特异性抗体检测蛋白和磷酸化蛋白的表达。

数据以平均值±标准差(x±s)表示。组间的差异使用单因素方差分析(ANOVA)进行测试，并进行配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验至少重复4次，并具有类似的结果。

在3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，加入5，10，20 μmol/L的乌地那非。结果发现，乌地那非可显著促进脂肪细胞的分化，表现为脂滴形成增加、脂肪细胞分化标志基因aP2的表达增加，且变化呈现剂量依赖性。见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 乌地那非对3T3-L1脂肪细胞分化的影响 A：油红染色；B：油红染色的定量分析；C：脂肪分化标志基因aP2的表达，n=4, 与对照组比较，**P＜0.01, ***P＜0.001; UDE 5，UDE 10，UDE 20分别表示乌地那非浓度为5，10，20 μmol/L

同时，乌地那非也以剂量依赖方式显著提高了3T3-L1脂肪细胞内脂联素蛋白的表达、以及培养液中脂联素的含量。见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 乌地那非对3T3-L1脂肪细胞内和培养液中脂联素含量的影响 A:乌地那非对3T3-L1脂肪细胞内脂联素表达的影响；B:图A中脂联素含量的定量分析；C：乌地那非对培养液中脂联素含量的影响；n=4；与对照组比较，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001；UDE 5，UDE 10，UDE 20分别表示乌地那非浓度为5，10，20 μmol/L; ADPN:脂联素

为观察乌地那非对PPARγ的影响，在3T3-L1前脂肪细胞培养分化为脂肪细胞的过程中，加入5，10，20 μmol/L的乌地那非。结果发现，与正常对照组比较，乌地那非以剂量依赖方式显著增加了PPARγ蛋白表达量、以及PPARγ的活性。当同时用100 μmol/L的特异性蛋白激酶G(protein kinase G, PKG)抑制剂和10 μmol/L的乌地那非处理时，发现PKG抑制剂可逆转乌地那非对PPARγ活性的影响。见图 3。

图 3(Figure 3)

图 3 乌地那非对PPARγ的蛋白表达和活性的影响 A:乌地那非对3T3-L1脂肪细胞PPARγ蛋白含量的影响；B:乌地那非对3T3-L1脂肪细胞PPARγ活性的影响；C: PKG抑制剂对乌地那非诱导的PPARγ活性的影响, n=4；与对照组比较，**P＜0.01, ***P＜0.001；UDE 5，UDE 10，UDE 20分别表示乌地那非浓度为5，10，20 μmol/L

为证实乌地那非对脂肪细胞分化、以及脂联素合成和分泌的影响经由PPARγ介导，3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化的过程中，同时接受1 μmol/L的PPARγ特异性抑制剂GW9662和10 μmol/L的乌地那非处理。结果发现，GW9662消除了乌地那非对脂滴形成、脂肪细胞分化标志基因aP2表达、细胞内脂联素含量以及培养液中脂联素浓度的促进作用。见图 4。

图 4(Figure 4)

图 4 PPARγ抑制剂降低乌地那非对3T3-L1脂肪细胞分化、脂联素合成与分泌的影响 A：PPARγ抑制剂对乌地那非促进的脂滴聚集的影响；B：图A中脂滴聚集的定量分析；C：PPARγ抑制剂对乌地那非促进的aP2 mRNA表达的影响；D：PPARγ抑制剂对乌地那非促进的细胞内脂联素表达的影响；E：PPARγ抑制剂对乌地那非促进的培养液中脂联素表达的影响，n=4；与对照组比较，** P＜0.01, ***P＜0.001；与乌地那非组比较，#P＜0.05, ##P＜0.01, ###P＜0.001；UDE：乌地那非

采用siRNA技术敲低3T3-L1前脂肪细胞中的PPARγ，并在前脂肪细胞分化的过程中加入10 μmol/L的乌地那非处理。结果发现，PPARγ siRNA可有效地降低PPARγ的蛋白表达，显著抑制乌地那非对脂滴形成、脂肪细胞分化标志基因aP2表达、细胞内脂联素含量以及培养液中脂联素浓度的促进作用。见图 5。

图 5(Figure 5)

图 5 敲低PPARγ降低乌地那非对3T3-L1脂肪细胞分化、脂联素合成与分泌的影响 A：敲低PPARγ对乌地那非促进的脂滴聚集的影响；B：图A中脂滴聚集的定量分析；C：敲低PPARγ对乌地那非促进的aP2 mRNA表达的影响；D：敲低PPARγ对乌地那非促进的细胞内脂联素表达的影响；E：敲低PPARγ对乌地那非促进的培养液中脂联素表达的影响，n=4，与对照组比较，*P＜0.05, ***P＜0.001；与乌地那非组比较，#P＜0.05, ###P＜0.001；UDE：乌地那非；KD：敲低

本研究结果发现，乌地那非可增强3T3-L1脂肪细胞的脂滴形成、提高脂肪细胞分化标志基因aP2 mRNA的表达、增加细胞内和培养液中脂联素的含量(图 1和图 2)，表明乌地那非具有促进脂肪细胞分化、增强脂联素合成与分泌的作用。

前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程受多种转录因子的调控，其中PPARγ和C/EBPα起着关键的作用^[8]。研究表明，C/EBPα的异位表达可诱导成纤维细胞转化为脂肪细胞^[9]，基因敲除小鼠的结果也证实C/EBPα是白色脂肪形成所需的^[10]。但由于①不表达PPARγ的前脂肪细胞不会分化为脂肪细胞；②在C/EBPα缺陷细胞中强制表达PPARγ也可诱导脂肪的生成；PPARγ因而被认为是脂肪细胞形成的主要调节因子^[11-13]。本研究结果表明：乌地那非可增加PPARγ的蛋白表达和活性，而采用特异性抑制剂和基因沉默方法抑制PPARγ可逆转乌地那非对脂肪细胞分化的影响，表现为脂滴形成的减少和脂肪细胞分化基因表达量的降低(图 3-5)，从而证实PPARγ介导了乌地那非促进脂肪细胞分化的作用。

PPARγ除具有在发育过程中诱导脂肪形成基因表达、促进脂肪重塑、调节脂肪细胞脂质储存功能外，还可调控脂肪因子合成与分泌，包括脂联素的合成与分泌^{[14, 15]}。此外，研究也表明：PPARγ的激活依赖于PKG ^[16]。与这些观点一致，本研究的结果证实，乌地那非通过PKG对PPARγ的调节而促进3T3-L1脂肪细胞的脂联素生成与分泌(图 2-5)。

总之，本研究结果证实，乌地那非通过增加PPARγ蛋白表达和提高PPARγ的活性，促进脂肪细胞的分化、以及脂联素的合成与分泌。由于脂联素的分子作用以及PPARγ的激活可提高骨骼肌和肝脏的胰岛素敏感性，乌地那非极有可能具备抗胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病相关疾病的生物学功能。