香菇多糖是卵巢癌化疗中最常见的辅助药物，可显著提高其疗效并降低并发症发生率，可能与香菇多糖提高T淋巴细胞免疫有关^{[1, 2]}。顺铂为卵巢癌综合治疗最常见的化疗药物，但其获得性继发性耐药发生率极高^[3]。有研究发现香菇多糖体外与肿瘤细胞共培养时可降低耐药基因表达，此外有研究发现香菇多糖自身可能对肿瘤细胞具有抑制作用。本研究采用香菇多糖联合顺铂作用于顺铂耐药A2780卵巢癌细胞，研究香菇多糖体外对卵巢癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。

顺铂耐药A2780卵巢癌细胞系购于美国典型培养物储藏中心(ATCC)；新生牛血清(NCS)、PBS和MTT购于上海碧云天生物科技有限公司；DMEM购于武汉博士德生物工程有限公司；香菇多糖购自南京绿叶思科药业有限公司；顺铂购自美国Sigma公司。A2780卵巢癌细胞培养基配置为10% NCS加90% DMEM，培养37 ℃、5% CO₂恒温培养箱。

香菇多糖冻干粉剂用纯水配制，顺铂用纯水配，根据药物处理方法将A2780卵巢癌细胞分为CON组(未行香菇多糖或顺铂处理)、DDP组(仅用顺铂处理，顺铂浓度为5 μg/ml)、LEN组(仅用香菇多糖处理，香菇多糖浓度0.5 μmol/L)及D+L组(香菇多糖联合顺铂处理，香菇多糖终浓度0.5 μmol/L，顺铂终浓度5 μg/ml)。CON组、DDP组、LEN组和D+L组细胞均设5组对照，药物处理6 h后用PBS洗涤3次，加入培养基培养待后续实验。

将CON组、DDP组、LEN组和D+L组细胞分别培养于24孔板(D0)，每组细胞各设3孔。采用MTT法检测四组细胞增殖，酶标检测仪检测波长490 nm下每孔细胞吸光度，吸光度=测得值-空白值，连续检测7 d (D1-D7)。以吸光度为纵坐标、时间为横坐标，绘制细胞增殖曲线。

采用BD FACSC anto Ⅱ流式细胞仪检测四组细胞药物作用6 h后周期(G₀/G₁期、S期和G₂/M期)及细胞凋亡率，并计算增殖指数(PI)=(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+G₂/M)。

四组细胞药物作用6 h后均采用RT-PCR法检测耐药基因(MDR1和MRP1基因) mRNA表达，以β-actin为对照，引物序列见表 1，反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共32个循环，最后一轮72 ℃延伸10 min, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后显影照相检测。分别统计四组细胞耐药基因光密度值，与内参对照计算比值。

表 1(Table 1)

表 1 MDR1、MRP1和β-actin基因RT-PCR引物序列 基因 上游引物 下游引物 MDR1 5′-TGACATTTATTCAAAGTTAAAAGCA-3′ 5′-TAGACACTTTATGCAAACATTTCAA-3′ MRP1 5′-TTCTAGTGTTGGACGAGGCT-3′ 5′-TGGCCATGCTATAGAAGACG-3′ β-actin 5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′ 5′-AGACGCAGGATGGCATGGG-3′

表 1 MDR1、MRP1和β-actin基因RT-PCR引物序列

采用Sigmaplot 12.5统计软件进行数据处理与统计学分析。计量资料采用x±s表示。四组细胞相关指标对比采用单因素方差分析(SNK法分别两两比较计算P值)。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

CON组、DDP组、LEN组和D+L组A2780顺铂耐药卵巢癌细胞D0的吸光度无明显差异(均P>0.05)；CON组、DDP组和LEN组细胞D1-D7的吸光度均无明显差异(均P>0.05)，D+L组细胞D1-D7的吸光度均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P < 0.05)(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 四组A2780细胞D0-D7吸光度对比 D+L组分别与CON组、DDP组和LEN组比较, *P < 0.05

CON组、DDP组和LEN组A2780顺铂耐药卵巢癌细胞G₀/G₁期、S期、G₂/M期、PI和细胞凋亡率的差异均无统计学意义(均P>0.05)，D+L组细胞G₀/G₁期和细胞凋亡率均显著高于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P < 0.05)，S期、G₂/M期和PI均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P < 0.05)(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 四组细胞细胞周期、PI和细胞凋亡率对比(x±s) 组别 G0/G1期(%) S期(%) G2/M期(%) PI (%) 细胞凋亡率(%) CON组 54.3±2.6 31.6±1.5 7.2±0.8 41.6±1.9 9.7±1.3 DDP组 54.6±2.8 32.1±1.8 7.3±0.9 41.9±1.7 9.9±1.4 LEN组 53.9±2.5 32.2±1.9 7.5±1.1 42.4±2.1 9.6±1.1 D+L组 71.4±3.1* 21.6±1.4* 1.8±0.6* 24.7±1.3* 31.1±3.6* D+L组分别与CON组、DDP组和LEN组比较，*P < 0.05

表 2 四组细胞细胞周期、PI和细胞凋亡率对比(x±s)

CON组和DDP组A2780细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05)，LEN组和D+L组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05)，CON组和DDP组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达显著高于LEN组和D+L组细胞(均P < 0.05)(图 2和图 3)。

图 2(Figure 2)

图 2 四组A2780细胞MDR1基因mRNA表达对比 LEN组、D+L组分别与CON组、DDP组比较，*P < 0.05

图 3(Figure 3)

图 3 四组A2780细胞MRP1基因mRNA表达对比 LEN组、D+L组分别与CON组、DDP组比较，*P < 0.05

顺铂是目前临床上卵巢癌综合治疗的一线用药，疗效显著且不良反应较少，但其极易发生继发性获得性耐药导致化疗失败，故降低顺铂的耐药性对提高卵巢癌的疗效至关重要。研究发现顺铂的耐药性与多药耐药基因和相关蛋白、凋亡相关基因、原癌基因及抑癌基因密切相关，其中多药耐药基因和相关蛋白是继发性获得性耐药最主要的机制^{[4, 5]}。目前发现与顺铂耐药相关的基因包括MDR1和MRP1，其中MDR1属于P-糖蛋白，含有二个ATP结合位点，与抗肿瘤药物结合后ATP结合位点结合ATP释放能量，可将抗肿瘤药物泵出细胞外，降低细胞内抗肿瘤药物水平而产生耐药^[6]；MRP1属于ATP依赖性扩膜转运蛋白，可将抗肿瘤药物逆浓度泵出到细胞外而降低抗肿瘤药物浓度，同时可抑制抗肿瘤药物与靶点结合，降低其作用效果^[7]。A2780卵巢癌细胞为目前公认的顺铂耐药细胞系，本研究中顺铂作用后对其细胞增殖及凋亡无明显影响，表明A2780卵巢癌细胞为研究顺铂耐药的理想细胞系。

香菇多糖为最常见的抗肿瘤辅助用药，目前认为香菇多糖抗肿瘤机制与其提高机体T淋巴细胞免疫有关，随着研究的深入，发现香菇多糖可能存在其他途径提高抗肿瘤药物疗效。本研究中，D+L组细胞D1-D7的吸光度、S期、G₂/M期和PI均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P < 0.05)，G₀/G₁期和细胞凋亡率均显著高于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P < 0.05)；LEN组和D+L组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05)，CON组和DDP组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达显著高于LEN组和D+L组细胞(均P < 0.05)，这些证据表明香菇多糖体外共培养可逆转A2780卵巢癌细胞对顺铂的耐药性，其作用机制可能与香菇多糖降低耐药基因MDR1及MRP1表达有关，该现象与袁昌劲等^[8]发现的香菇多糖可降低耐药基因表达基本一致，为临床应用中香菇多糖改善抗肿瘤药物耐药提供理论依据。

本研究中CON组、DDP组和LEN组细胞增殖、细胞周期及凋亡无明显差异，说明香菇多糖自身并未对A2780卵巢癌细胞表现出直接抑制作用，但有研究发现香菇多糖自身对肿瘤细胞具有直接抑制作用。桂明杰等^[9]发现香菇多糖对HepG2及H22肿瘤细胞具有良好的细胞毒性，对体内肿瘤的抑制率高于环磷酰胺；樊瑞新^[10]发现香菇多糖对卵巢癌细胞株SKOV3增殖具有显著的抑制作用，但具体作用机制不明确；郑琼^[11]研究发现香菇多糖可能通过升高Bax表达、降低Bcl-2和PCNA表达而抑制HEC-1B细胞的增殖。此外有发现香菇多糖可能通过诱导细胞周期阻滞和激活ERK1/2信号通路显著抑制SGC-7901胃癌细胞生长^[12]。结合目前研究进展，推测香菇多糖可能通过改善多药耐药基因表达而降低A2780卵巢癌细胞对顺铂的耐药性，而与自身直接抑制肿瘤细胞无关，与香菇多糖对其他肿瘤细胞具有直接抑制作用不同。值得注意的是，目前香菇多糖抑制肿瘤的研究主要集中在香菇多糖对免疫的影响，但笔者认为香菇多糖可能具有多种作用机制抑制肿瘤，其改善抗肿瘤药物的耐药性可能同样存在多种作用机制，这些机制有待于进一步研究。