乳腺癌是女性肿瘤患者中，发病率最高的肿瘤之一^[1]。乳腺癌，尤其是雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)均为阴性的三阴性乳腺癌，患者往往早期就出现转移，并对化疗药物出现耐药，预后凶险；即使对于非三阴性乳腺癌，如果术后出现复发或者转移，患者的预后也往往不良^[1]。结构特异性识别蛋白1(structure specific recognition protein 1，SSRP1)是一种与转录调控、DNA损伤修复以及细胞周期调控相关的蛋白^[2]。SSRP1在人体正常成熟组织中表达量低，而在多种分化程度较低和癌变组织中，SSRP1则为高表达，提示SSRP1可能对维持肿瘤细胞样表达谱具有关键作用^{[3, 4]}。本研究利用GEO公共数据集，分析SSRP1在乳腺癌中的表达情况，分析其与患者预后的关系，探寻SSRP1调控乳腺癌发展的机制，为进一步研究该基因的功能、机制和临床意义提供线索和思路。

我们从NCBI的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下载基因表达谱公共数据集，包括乳腺癌样本数据集GSE3494和GSE47561。上述所有数据集的数据均导入dChip软件还原原始芯片扫描图像，之后用总荧光强度为中位数的芯片N2为基准进行标准化处理，再进行后续计算和分析。

GSE3494，样本量大且附带临床信息，可进行进一步的回顾性和生存期分析研究。根据表达谱数据，对样本的SSRP1的表达进行由高到低排序后，前20%的样本作为高表达组，后80%的样本作为低表达组。SSRP1的相对表达量以探针信号强度(intensity)正态分布化后的log₂intensity值衡量。

采用GSEA2.0.14版本(JAVA版本)进行分析。数据集GSE47561被纳入GSEA。肿瘤组织样本根据SSRP1的表达水平被分为高低表达两组(前50%的样本作为高表达组，后50%的样本作为低表达组)，之后通过GSEA分析SSRP1的表达水平对各种基因集(gene ontology)的影响。我们从GSEA网站MsigDB数据库中获得的基因集作为参照基因集，按default weighted enrichment statistic的方法，每次分析重复1 000次。

作图及统计学处理软件使用GraphPad Prism 5。回顾性研究中，组间比较采用联列表法，采用卡方检验；生存期分析研究中，Log-Rank (Mantel-Cox)法用于生存分析。以P＜0.05作为有统计学意义；在GSEA中，P＜0.05及错误发现率(false discovery rates, FDR)＜0.05的基因集作为显著富集基因集。

为了探讨SSRP1的表达与乳腺癌患者临床病理资料的相关性，我们利用GSE3494中的临床资料进行了回顾性分析。在乳腺癌样本数据集GSE3494中，在不同年龄(P=0.001 8)、p53水平(P＜0.000 1)、p53突变(P＜0.000 1)、ER水平(P=0.000 2)、PR水平(P=0.011 6)、Elston组织学分级(P＜0.000 1)分组的样本中，SSRP1的表达均有显著性差异；而SSRP1与患者的肿瘤大小及淋巴结浸润情况无显著相关性(P＞0.05)，见表 1。这说明SSRP1可能影响了p53的表达，又因为其是调节DNA损伤修复的关键蛋白^[2]，它的异常表达还可能造成p53的突变异常；SSRP1表达与ER、PR表达的显著相关性，也提示SSRP1可能是三阴性乳腺癌的重要治疗靶点。

表 1(Table 1)

表 1 SSRP1与乳腺癌患者(GSE3494)的临床病理指标的相关性 病理指标 患者 SSRP1表达水平 卡方值 P 数目 高 低 年龄(岁)   ≤55 75 24 51 9.78 0.001 8   ＞55 176 26 150 p53水平   阳性 58 24 34 21.77 ＜0.000 1   阴性 193 26 167 p53突变   是 72 28 44 22.77 ＜0.000 1   否 179 22 157 ER水平   阳性 213 35 178 13.92 0.000 2   阴性 34 15 19 PR水平   阳性 190 31 159 6.37 0.11 6   阴性 61 19 42 Elston组织学分级   1 67 5 62 21.37 ＜0.000 1   2 128 23 105   3 54 22 32 肿瘤大小(cm)   ≥2 139 30 109 0.54 0.462 6   ＜2 112 20 92 淋巴结浸润   是 84 21 63 1.48 0.224 2   否 158 29 129

表 1 SSRP1与乳腺癌患者(GSE3494)的临床病理指标的相关性

为了研究SSRP1是否能作为肿瘤预后的评价分子，我们又进行了前瞻性分析。在肝癌样本数据集GSE3494中，SSRP1高表达组患者和低表达组患者的5年生存率分别为76.57%和85.50.%，Log-Rank=4.980，P=0.025 6(图 2A)。以上结果说明SSRP1的高表达与乳腺癌患者术后早期死亡有关。

图 1(Figure 1)

图 1 Kaplan-Meier法分析SSRP1表达水平与乳腺癌预后的关系(GSE3494)

图 2(Figure 2)

图 2 GSEA分析显示SSRP1高表达的乳腺癌样本富集了与DNA复制(A)、细胞周期(B、C)、有丝分裂(D)、DNA损伤修复(E、F)有关的基因集 P＜0.05及FDR＜0.05的基因集作为显著富集基因集

分析SSRP1与乳腺癌患者的预后关系之后，我们继而对SSRP1推动乳腺癌进展的可能方式进行了探讨。我们利用乳腺癌样本数据集GSE47561，使用GSEA方法，分析SSRP1的表达水平对各种细胞功能基因集的影响。我们使用“go ontology”作为参照基因集，可见SSRP1高表达的肿瘤样本富集了与DNA复制、有丝分裂、细胞周期和DNA损伤修复相关的基因集(图 2)。以上结果与已发表的文献中证明的SSRP1的功能相一致，说明SSRP1可能通过调节肿瘤的细胞分裂以及DNA损伤修复，影响肿瘤细胞的增殖和耐药等表型。

SSRP1和SUPT16(suppressor of Ty 16 homolog)共同构成了FACT (Facilitates chromatin transcription)。FACT是转录和复制因子，以组蛋白分子伴侣的形式发挥生物学功能，可以与H2A/H2B组蛋白二聚体相互作用，协助DNA分子从组蛋白八聚体上解开，降低核小体的致密性，促进转录过程中延伸步骤的进行^{[5, 6]}。另外，FACT可以通过影响RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ影响基因转录的进程^{[7, 8]}。鉴于以上原因，FACT对于维持细胞的转录活性至关重要。肿瘤细胞是高转录活性细胞的代表，所以FACT可能是维持肿瘤细胞生物表型的关键蛋白。有研究发现，SSRP1对基因转录的调控作用既可以通过SUPT16依赖的方式进行，也可以独立进行^[9]；另外，SSRP可以作为转录因子p63的共激活因子^[10]。综上所述，我们推测，SSRP1是调控乳腺癌肿瘤细胞转录活性的关键分子。

有丝分裂是细胞分裂的最终步骤，有丝分裂的调节在细胞增殖、胚胎形成和肿瘤发生过程中都有重要意义。有丝分裂的完成必然伴随着DNA的复制。研究证实，FACT对于维持细胞DNA的正常复制具有重要作用--SSRP1敲除的DT40细胞，细胞周期S期进展被阻滞，增殖停止^[11]。进一步探讨其机制发现，SSRP1敲除虽然不影响DNA复制的起始步骤，却导致DNA复制的延伸过程中DNA合成减少^[11]。另一方面，推动有丝分裂进行的“机械装置”是由α和β微管蛋白形成的微管，因而微管的多聚化对于细胞的增殖十分关键。新近的研究证实，SSRP1是微管的绑定蛋白，可以通过促进微管的多聚化促进细胞的有丝分裂^[12]。

实际上，SSRP1已经被证实为是肿瘤治疗的靶点，国外已有相应的靶向药物进入临床前实验：特异性抑制SSRP1的化合物Curaxins可以调控p53通路和NF-κB通路，从而通过诱导肿瘤细胞凋亡阻遏多种肿瘤细胞的增殖^[13]；有研究者利用可以自发发生乳腺癌的Her2/neu转基因小鼠为模型，检测Curaxins对乳腺癌发生的预防作用，结果显示，该靶向化合物可以减少肿瘤发生率、延缓肿瘤进展、延长小鼠的总体生存期^[14]。一项新近的研究则发现，在非小细胞肺癌细胞中抑制SSRP1可以显著提高细胞对靶向药物厄洛替尼的敏感性，促进非小细胞肺癌细胞系的凋亡^[15]。以上结果进一步提示了SSRP1在肿瘤发生发展中起到的作用，并展现了其抑制剂乐观的临床应用前景。

在本研究中，我们结合临床资料分析和生物信息学，证实SSRP1在乳腺癌组织中高表达，与患者的术后远期生存相关，并可以调控与DNA复制、有丝分裂、细胞周期和DNA损伤修复相关的基因集，提示其可以作为乳腺癌治疗的靶标。