视网膜Müller细胞是视网膜中最主要的胶质细胞，占视网膜胶质细胞的90%以上，基于其在视网膜的重要性，视网膜Müller细胞在视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)研究中占据重要地位，也一直是视网膜病变的研究热点。近年有研究发现，糖尿病视网膜病变时，Müller细胞中滑面内质网发生病理改变也即内质网应激，参与视网膜神经元及血管细胞的凋亡^{[1, 2]}。P58^IPK在视网膜内质网应激中发挥重要作用，内质网应激时，P58^IPK(58-kilodalton inhibitor of protein kinase)被诱导表达，通过阻止蛋白进入内质网进行折叠和组装来减少内质网的蛋白负荷，调节内质网稳态及凋亡，保护神经元细胞^[3]。本实验拟体外培养Müller细胞株(rMC-1)，建立高糖模型，构建P58^IPK基因敲除/P58^IPK基因过表达质粒并转染到Müller细胞中，初步探讨P58^IPK基因在在高糖诱导视网膜Müller细胞内质网应激PERK通道中的作用，为进一步研究P58^IPK抑制DR的机制奠定基础，为阐明糖尿病视网膜病变发病机制提供新的理论依据，并有望为临床干预及治疗糖尿病视网膜病变的发生发展提供新的治疗靶点。

本实验研究对象为Müller细胞株(rMC-1)，系武汉大学生命与科学学院馈赠，来源为大鼠视网膜Müller细胞。

胎牛血清(美国HyClone公司)，DMEM(美国HyClone公司), 双抗(青霉素-链霉素)、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)，SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-actin抗体、Rabbit anti-GFAP、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德公司)，p-PERK多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，37 ℃, 5%CO₂培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，垂直电泳槽(六一仪器厂)，实时荧光定量PCR仪(ABI公司)，水平电泳仪、紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，800型台式低速离心机(上海医疗器械有限公司)，显微镜成像系统(日本OLYMPUS)，微量移液器(美国Eppendorf公司)。

Müller细胞株(rMC-1)的培养。使用含80%DMEM、20%胎牛血清、1%双抗(青霉素-链霉素)的培养基，置于37 ℃、95%空气、5% CO₂的密闭恒温密闭培养箱内培养。β-actin F：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′, β-actin R：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，扩增片段长度为240碱基对(bp)，PERK F: 5′-CCCCATCCCAAGAGGACCTAAAT-3′，PERK R: 5′-CTGGTTCATCTGTCGGATCATAGT-3′，扩增片段长度为234 bp。P58^IPK基因过表达/P58^IPK基因敲除质粒构建。P58^IPK F：5′-GAAGTTTGATGACGGAGAAGACC-3′, P58^IPK R：5′-ATTGAACCCTTGCCATGAGTCCC-3′，扩增片段长度为188 bp。高糖模型的建立参照文献[45]，本课题在之前的研究基础上选取25 mmol/L葡萄糖浓度作用48 h制备Müller细胞高糖模型。

将正常培养的Müller细胞，以细胞密度1×10⁵/ml接种于预置盖玻片的6孔板，取融合密度达70%的细胞用于实验，分为：正常对照组：5 mmol/L葡萄糖组、高糖组：25 mmol/L葡萄糖组、阳性对照组：25 mol/L甘露醇组。将经过高糖处理48 h后的细胞按转染质粒的不同分为3组：①未转入质粒组；②P58^IPK过表达质粒转染组；③P58^IPK基因敲除质粒转染组。PCR检测各组P58^IPKmRNA表达量，并与转染之前各组P58^IPKmRNA表达量进行比较。荧光定量PCR检测各组Müller细胞PERK mRNA的表达。Western Blot检测各组Müller细胞p-PERK蛋白的表达。

采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测P58^IPKmRNA表达量。以细胞密度1×10⁵/ml接种于预置盖玻片的6孔板，待细胞融合密度达70%时，分别加入5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖、25 mol/L甘露醇处理48 h，取Müller细胞检测P58^IPKmRNA表达量。高糖处理48 h后细胞进行P58^IPK基因敲除/58^IPK基因过表达质粒转染，转染24 h后检测P58^IPKmRNA表达量。

采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测P58^IPK基因对高糖刺激的Müller细胞内PERK mRNA表达的影响。以细胞密度1×10⁵/ml接种于预置盖玻片的6孔板，待细胞融合密度达70%时，分别加入5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖、25 mol/L甘露醇处理48 h，高糖处理48 h后细胞进行P58^IPK基因敲除/58^IPK基因过表达质粒转染，细胞转染24 h提取各组细胞总RNA，逆转录以cDNA作为模板，以β-actin作为内参，采用采用2^－ΔΔCt分析法分析结果。

采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测P58^IPK基因对高糖刺激的Müller细胞内PERK mRNA表达的影响。以细胞密度1×10⁵/ml接种于预置盖玻片的6孔板，待细胞融合密度达70%时，分别加入5 mmol/L葡萄糖、25 mmol/L葡萄糖、25 mol/L甘露醇处理48 h，高糖处理48 h后细胞进行P58^IPK基因敲除/58^IPK基因过表达质粒转染，细胞转染24 h后取各组细胞样品，提取细胞中总蛋白。将蛋白样品进行适当稀释，制成蛋白浓度为1，0.8，0.6，0.4，0.2标准蛋白。将PBS、稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20 μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50:1比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，37 ℃避光孵育30 min, 用DG-3022A酶标仪测定OD₅₆₈。根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。用微量加样器将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔, 各样品总蛋白量为35 μg。加样后电泳分离目的蛋白，转膜后，用含5%脱脂奶粉的封闭液(TBST)封闭2 h，加入一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。P-PERK以1:800稀释；β-actin以1:500稀释，二抗：TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5 min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗以1:50 000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。显色曝光，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

免疫组织化学SABC法进行细胞鉴定是鉴定视网膜Müller细胞特异性的方法，其阳性表现是细胞质内出现棕黄色丝网状或颗粒状物质，鉴定过程是随机抽选5个显微镜视野(×400)进行观察，有此表现，鉴定即为视网膜Müller细胞。

荧光定量PCR数据分析：经凝胶图像分析软件扫描，QualityOne软件测定目的基因表达条带的灰度值。样品中待测基因的相对表达量定义为目的基因cDNA拷贝数与同一样品中GAPDH拷贝数的比值。计算出各指标的相对表达量后进行统计分析。

Western Blot数据分析：计算机扫描图像，BandScan检测各条带面积及灰度值。以各组细胞各目的蛋白和内参蛋白的蛋白条带的单位面积内的灰度比值来反映目的蛋白的相对表达水平，计算公式为：目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。计算出各指标的相对表达量后行统计分析。

采用SPSS 17.0计算机软件做统计学分析，所得计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两个样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较用单因素方差分析，组间的多重比较采用SNK检验；当P＜0.05认为其差异具有统计学意义。

光学显微镜下观察视网膜Müller细胞结构，本实验所采用的Müller细胞呈在镜下表现为多种形态，如星形、长梭形、多角形等，细胞胞质丰富，核膜非常清晰，彼此间隔清晰，细胞核多位于细胞体中央，胞核大，易辨认。为保证实验对象的准确性，我们对培养的视网膜Müller细胞采用特异性鉴定方法，免疫组织化学SABC法所养细胞进行鉴定，在镜下观察其特征性标识物GFAP的表达，抗原抗体结合后表现为黄色丝网状或颗粒状物质，显示结果为95%以上细胞均为视网膜Müller细胞(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 Müller细胞免疫组化染色图像(×400) A:可见细胞呈长梭形，细胞质丰富，细胞核位于细胞体中央, GFAP免疫组化染色阳性; B:阴性对照; C:免疫组化GFAP染色阳性

Müller细胞经不同培养基处理48 h后荧检测各组P58^IPKmRNA的表达见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 Müller细胞经不同培养基处理48 h后荧检测各组P58IPK mRNA的表达 A：对照组片段，2-4均为β-actin；B: P58IPK片段; 2-4条带分别为5 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L甘露醇

Müller细胞转入不同质粒24 h之后检测各组P58^IPKmRNA的表达见图 3。

图 3(Figure 3)

图 3 Müller细胞转入不同质粒24 h之后检测各组P58IPKmRNA的表达 A：对照组片段，2-10均为β-actin；B：P58IPK基因片段；2，5，8条带：未转染组；3，6，9条带：P58IPK基因敲除组；4，7，10条带：P58IPK过表达组

采用2^－ΔΔCt分析法检测转染效果，转染后各组P58^IPKmRNA表达与未转染质粒相比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。但在不同糖浓度条件下，各组PERK mRNA的相对表达量相比，差异没有统计学差异(P＞0.05)，在相同糖浓度条件下，各组之间PERK mRNA的相对表达量相比，差异没有统计学差异(P＞0.05)。分别为未转染质粒组，5 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量1.000 0±0. 000 0，25 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量1.069 7±0. 313 8。转染P58IPK基因敲除质粒组5 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量1.261 9±0.150 0，25 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量1.375 0±0.502 8。转染P58IPK基因过表达质粒组5 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量0.937 4±0.195 9，25 mmol/L糖浓度下培养时PERK mRNA的相对表达量1.038 0±0. 086 1。而在不同糖浓度条件下，各组内p-PERK蛋白的表达量相比，差异有统计学差异(P＜0.05)。在相同糖浓度条件下，各组之间p-PERK蛋白的表达量差异有统计学差异(P＜0.05)。分别为未转染质粒组5 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.413 0±0. 026 1，25 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.537 0±0.003 5。转染P58^IPK基因敲除质粒组5 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.518 0±0.006 6，25 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.820 0±0. 009 5。转染P58^IPK基因过表达质粒组5 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.258 0±0.003 1，25 mmol/L糖浓度下培养时p-PERK蛋白的表达量0.373 0±0.022 9。正常糖浓度培养下的Müller细胞中检测出p-PERK蛋白的表达较低，而在高糖环境下Müller细胞中检测出p-PERK蛋白的表达水平升高。

Müller细胞在维持视网膜内稳态中起重要作用^[6]。近年有研究发现，糖尿病视网膜病变时，Müller细胞中滑面内质网发生病理改变也即内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，参与视网膜神经元及血管细胞的凋亡^[1]。内质网应激时，未折叠或错误折叠蛋白在内质网内蓄积，这些改变会首先触发未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR是在适度ERS下细胞启动的一种适应性保护机制，主要是通过减少蛋白翻译、上调分子伴侣表达、降解未折叠蛋白产生以下效应: ①早期阶段，通过激活双链RNA依赖蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK)，从而引起蛋白质的合成减缓；②上调ERS相关基因以及蛋白的表达, 使错误折叠或未折叠的蛋白恢复正常；③上调能促进蛋白降解的基因的表达，未折叠蛋白在未进入内质网之前发生降解，从而减轻应激反应，减轻内质网网蛋白负荷。UPR能缓解内质网应激反应，但当内质网应激时间过长或过强时，未折叠蛋白反应不能减轻内质网应激，将通过不同的途径诱导细胞凋亡^{[7, 8]}。早期的UPR可以促进蛋白质正常合成，清除不能修复的异常细胞，维持细胞的正常生理功能和内环境的稳态，但过度的UPR则会引起钙离子稳态失衡、脂质代谢紊乱、细胞凋亡等，从而造成组织和细胞的损害。P58^IPK[58-kilodalton (inhibitor of protein kinase)protein]又名DNAJC3，是内质网分子伴侣基因，抑制内质网激酶磷酸化及转录^{[9, 10]}。内质网应激时，其被诱导表达，抑制PERK的激活，通过阻止蛋白进入内质网进行折叠和组装来减少内质网的蛋白负荷，减少蛋白质的翻译和合成，减少ERS对细胞的损伤^[3]。还可抑制葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein，GRP78)、ATF4、CHOP和VEGF等PERK信号通路下游分子的表达。

本研究通过检测不同葡萄糖浓度培养48 h后视网膜Müller细胞中的内质网应激蛋白PERK mRNA及其活化形式p-PERK蛋白的表达。结果发现体外培养的视网膜Müller细胞，通过不同的葡萄糖浓度进行干预后，正常糖浓度培养下的Müller细胞中检测出p-PERK蛋白的表达较低，而在高糖环境下培养会使Müller细胞中内质网应激蛋白p-PERK的表达水平升高。这就说明在高浓度葡萄糖的刺激下，视网膜Müller细胞会出现内质网应激反应，激活PERK信号通路，从而使PERK的活化形式：磷酸化的PERK蛋白的表达水平增加。高糖培养下各组Müller细胞中PERK mRNA的表达量与正常组相比并没有出现明显的差异。考虑可能是因为p-PERK主要是在翻译水平和翻译后来进行调节，即对p-PERK的调节主要是通过对蛋白进行磷酸化修饰来激活其活性，而与mRNA转录水平调节无关。在高浓度葡萄糖的刺激下，视网膜Müller细胞会出现内质网应激反应；而P58^IPK在内质网应激过程中扮演抑制剂的角色，抑制了PERK的激活，PERK激活抑制将阻止蛋白进入内质网进行折叠和组装而减少内质网的蛋白负荷，减少蛋白质的翻译和合成，减少ERS对细胞的损伤。