阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)是发病率较高的一类疾病。它严重威胁着公众的健康，增加了心血管疾病的发病率及死亡率。OSA导致心血管疾病的主要机制是慢性间断性缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)，即慢性间歇性的缺氧复氧 。CIH在心血管疾病的发生发展中起着关键作用。红景天苷具有抗辐射、抗缺氧、抗疲劳、抗衰老的功效，对缺血再灌注的心脏具有一定的保护作用。研究者发现，红景天苷能够抑制缺血再灌注下血管内皮细的凋亡^[3]。那么，红景天苷对慢性间断性缺氧心肌细胞的凋亡是否具有抑制作用，其机制如何?还不清楚。

SD大鼠(200-250 g，8周龄，雌雄不限)均来自武汉大学动物实验中心。 将SD大鼠分别放入慢性间断性缺氧动物仓中。动物仓内气体浓度由单片机程序控制，交换循环给予氮气和空气(21% O₂)，亦即将仓内充入氮气40 s，仓内的氧 浓度逐渐下降，至下降为4%-5%后则充入空气，仓内氧浓度又迅速恢复到21%，仓内氧气浓度由与计算机相连的氧浓度探测仪进行实时监控。依此循环，每天循环8 h(8∶00至16∶00)，其余时间置大鼠于笼中饲养，正常室温、空气和饮食。连续间断缺氧4周或8周。为了标准化环境信号对动物的整合作用，实验前，大鼠置于反时相的人工光照(6∶00至18∶00时黑暗，18∶00至6∶00时光照)下饲养3 d，昼夜节律颠倒。实验中尽量保证大鼠处于安静状态，饮食自由，尽量减少不必要的应激反应。

将实验大鼠随机分为以下几组：①正常对照组(n=10)：每日在相同的时间放置入相同规格的动物仓内，输入空气，无缺氧； ②NaCl组(CIH+ NaCl，n=10)：慢性间断性缺氧8周，间隔(每周2次)腹腔注射0.9% NaCl 溶液。③红景天苷组(CIH+红景天苷，n=10)：慢性间断性缺氧4或8周，间隔(每周2次)腹腔注射红景天苷 溶液。

检测大鼠的心功能：心脏超声多普勒测量大鼠的各腔室内径(LAD、RAD、LVD、RVD)。于乳头肌水平短轴，M型取样，测量左室射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、左心室舒张末容积(EDV) 和左心室收缩末容积(ESV)。

提取大鼠的心室肌组织，用石蜡包埋,应用原位末端标记(TUNEL)法，检测凋亡心肌细胞。根据显示阳性的凋亡心肌细胞的分布情况,计算显示为阳性细胞所占的百分比，即为凋亡细胞的阳性指数。

提取心室肌组织，将100 mg心室肌组织放入1 ml 的RIPA裂解液，在冰上充分匀浆后，4 ℃下离心(12 000 g)20 min,取离心后的上清，Lowry法测定蛋白浓度，取50 μg的总蛋白上样并电泳，根据蛋白的不同分子量配制8%的聚丙烯酰胺(PAGE)胶电泳。据预染Marker的显示结果，判断目的蛋白，充分分离后，停止电泳。取出凝胶根据Marker切下的目的条带，用蒸馏水进行冲洗，剪出与聚偏二氟乙烯(PAGE)凝胶大小相同的PVDF膜及滤纸，用甲醇浸泡PVDF膜数秒，然后和滤纸一起浸泡在电转缓冲液中。转膜完成后，将PVDF膜置入含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)中浸泡，室温下、摇床封闭2 h。封闭液稀释相对应的一抗，将PVDF膜浸泡在一抗(小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax和caspase-3抗体，Santa Cruz公司)孵育液中，于4 ℃下孵育过夜。用TBST液体充分洗涤PVDF膜，后用封闭液稀释对应的二抗(辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG，KPL公司)，稀释比1∶50 000，将PVDF膜浸泡在二抗孵育液中，室温下摇床孵育2 h。将PVDF膜用TBST充分洗涤5到6次。在每张膜上滴加适宜的增强化学发光(ECL)底物液，室温下孵育数分钟。等待荧光带明显后，再用滤纸吸去多余的底物液，并覆上保鲜膜，X光胶片压片，然后依次放入显影液中显影、定影液中定影。BandScan分析计算胶片的灰度值，用各组心肌细胞内β-actin的含量作为标准确定X光片上Bcl-2、Bax蛋白及caspase-3蛋白的相对含量。所用封闭液、ECL试剂均来自于KPL公司生产的Western Blot试剂盒。

提取心室肌组织100 mg匀浆，离心，然后加入50 μl冷caspase-3裂解缓冲液中，冰浴10 min。4 ℃下离心15 000 g×3 min。上清液转管，取出样品加入50 μl 2×反应缓冲液 中,37 ℃温浴30 min，作为平衡操作对照，其余各管置于冰上，30 min后将其加入50 μl 2×反应缓冲液(含10 mmol/L DTT)；每管均加入5 μl 1 mmol/L 的 Caspase-3底物(DEVD-pNA)，在37 ℃下孵育1 h；然后将各管溶液转入96孔酶标板上，酶标仪上读取405 nm处的吸光度值。根据吸光度值在标准曲线上找到相应的值，以每分钟每毫克蛋白质产生的pNA摩尔质量表示caspase-3的酶活性。

数据均以均数±标准差 (x±s) 来表示，SPSS 13.0统计软件统计分析，组间的比较采用t检验及方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

干预后8周，与NaCl组比较，红景天苷组大鼠的心功能得到明显改善，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 红景天苷对大鼠心功能的影响 指标 正常对照组 (n=10) NaCl组 (n=10) 红景天苷组 (n=10) LVDd(cm) 0.556±0.050 0.595±0.474 0.580±0.445** LVDs(cm) 0.345±0.046 0.427±0.064 0.394±0.044 EDV(ml) 0.095±0.050 0.144±0.031 0.133±0.025** ESV(ml) 0.504±0.036 0.572±0.064 0.557±0.061 EF(%) 82.04±3.11 75.74±3.09 76.74±3.13 FS(%) 41.14±2.39 38.16±2.16 38.81±2.13 与NaCl 组比较，**P＜0.05

表 1 红景天苷对大鼠心功能的影响

干预8周后，心肌组织均可见凋亡小体，红景天苷组缺氧心肌的凋亡小体明显减少(P＜0.05)，见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 红景天对慢性间断性缺氧心肌细胞凋亡的影响 A:TUNEL检测心肌细胞凋亡(×400)，正常心肌细胞核呈蓝色,凋亡细胞核呈深浅不一的棕红色颗粒状；B:凋亡心肌细胞量化分析。TUNEL阳性细胞占心肌细胞百分比，与NaCl组比较，*P＜0.05

为明确红景天苷对抗心肌细胞凋亡的机制，我们分析了慢性间断性缺氧心肌细胞中调节凋亡蛋白Bcl-2及Bax的表达情况。干预8周后，NaCl组心肌组织凋亡蛋白Bcl-2的表达减少，蛋白Bax的表达增加，红景天苷组Bcl-2表达减少而Bax表达则增加，见图 2。提示红景天苷可能通过平衡Bcl-2和Bax的表达来调节细胞凋亡。

图 2(Figure 2)

图 2 红景天苷对凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax蛋白含量的影响 A: Bcl-2和Bax的Western Blot检测结果；B: Bcl-2和Bax对β-actin的相对表达量，与NaCl组比较，*P＜0.05

在细胞凋亡中，caspase-3激活裂解，最终致凋亡发生。为此，我们观察了CIH中心肌组织caspase-3的表达及活性情况。干预8周后，NaCl组心肌组织caspase-3的蛋白表达及活性增加，而红景天苷组caspase-3的蛋白表达及活性降低，见图 3。提示红景天苷可能通过抑制caspase-3的表达及活性来调节细胞凋亡。

图 3(Figure 3)

图 3 红景天苷对caspase-3蛋白表达及活性的影响 A: caspase-3的Western Blot检测结果；B: caspase-3对β-actin的相对表达量；C：caspase-3的活性；与NaCl组比较，*P＜0.05

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是发病率较高的一类疾病，严重威胁着公众健康。它增加了心血管疾病的发病率及死亡率。目前OSA致心血管疾病发生发展的机制仍未完全清楚，它包含许多病理生理触发机制，已有研究显示OSA导致心血管疾病的主要机制是慢性间断性缺氧(CIH)即慢性间歇性的缺氧复氧。CIH在心血管疾病的发生发展中起着关键作用 ^[4-6]。

红景天苷是一种类苯基丙烷糖苷，它通过抗氧化、抗氧自由基和诱导干细胞等而对各种细胞产生保护作用。已有研究显示红景天苷具有抗细胞凋亡作用^[7]，它的这种抗凋亡作用可能与其抗氧化、抗氧自由基以及一些还未研究清楚未知的机制有关。研究已经证实，给予脑挫伤的小鼠剂量20 mg/kg的红景天苷，能帮助减少神经元的死亡及凋亡，减轻脑水肿，进而减少脑的损伤，帮助脑功能的恢复。

我们在研究中观察到，慢性间断性缺氧4周，心肌细胞出现凋亡；间断缺氧8周，心肌细胞凋亡明显增加。所以我们选取慢性间断性缺氧8周作为观察的实验点。而给予20 mg/kg的红景天干预后，心肌细胞凋亡数目则明显减少。提示红景天可减少慢性间断性缺氧后心肌细胞的凋亡，因此，我们就其机制做了进一步研究。

Bcl-2和Bax是两种作用相反的凋亡调节基因的表达产物,它们共同作用于细胞凋亡的发生过程。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用,而Bax则促进细胞凋亡 ^[8,9]。慢性间断性缺氧8周后，大鼠心肌细胞Bax的蛋白表达增加，Bcl的蛋白表达减少。

Caspase-3是白细胞介素-1β转换酶家族中一员。当细胞表面的死亡受体被激活时，凋亡过程启动，位于上游调控位置的caspase被激活，继而引发下游效应caspase-3水解激活，启动级联反应，最终导致细胞凋亡^[10]。慢性间断性缺氧8周后，大鼠心肌组织caspase-3蛋白表达量及活性均增加，与NaCl组比较，红景天苷组caspase-3的表达减少，caspase-3的活性亦降低。

我们通过研究证实了红景天苷对慢性间断性缺氧心肌的保护作用：①慢性间断性缺氧8周后，大鼠心功能下降，红景天苷治疗则能改善心功能。②慢性间断性缺氧，大鼠心肌细胞出现凋亡，红景天苷通过调节凋亡调节蛋白的表达，抑制caspase-3 的活性而减少缺氧心肌细胞的凋亡。

综上所述，在慢性间断性缺氧即呼吸暂停动物模型中，红景天苷可改善心功能,并通过调节Bcl-2 /Bax的表达,抑制caspase-3的酶活性发挥其抗缺氧心肌细胞凋亡的作用。慢性间断性缺氧是各种心脏疾病发生的重要危险因素，红景天苷的干预，可能对睡眠呼吸暂停患者的心肌产生一定的保护作用。