急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，是肾脏疾病常见的临床综合征，其发病率逐年攀升，危重患者中AKI死亡率约为35%-70%^[1]。TLR4作为革兰阴性菌胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的主要受体，在AKI的发生发展中得到越来越多的重视。TLR4广泛表达于多种细胞中，在肾脏则表达于肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、肾小球系膜细胞等^[2]。近期研究发现TLR4在各种原因导致的急性肾损伤中发挥重要作用^[3]，但其在肾脏炎症反应信号通路中所发挥的作用尚不明确。我们研究TLR4在肾小管上皮细胞中的表达及LPS介导的MAPK信号通路的影响，探讨其在肾脏炎症反应过程中发挥作用的机制。

健康雄性SD大鼠术前禁食12 h，自由饮水。4%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉，固定、铺无菌洞巾；采用Rittirsch的方法，腹正中切口1.5 cm，找到盲肠，在盲肠根部用3-0丝线结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管，并用18 G针头对穿2次，防止针孔闭合，挤压盲肠致有粪便溢出。之后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。术毕，立即给大鼠皮下注射0.9%氯化钠注射液2 ml/100 g抗休克。

大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E，美国ATCC)，胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco)，DAPI染色试剂盒(江苏碧云天)，BCA试剂盒(美国Hyclone Picrce)，TLR4抗体(美国abcam)，TLR4阻断剂TAK-242(5 μmol/L，6 h，美国Invitrogen)，p-38、JNK通路抑制剂SB202190(10 μmol/L，1 h，美国CST)、SP600125(25 μmol/L，30 min，美国CST)，p38兔多克隆抗体、磷酸化(p)-p38兔单克隆抗体、JNK兔多克隆抗体、磷酸化(p)-JNK兔单克隆抗体(美国CST)，β-actin鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记的二抗(美国CST)、羊抗小鼠二抗(美国Thermo Scientific)，荧光显微镜(奥林巴斯BX51)，奥德赛近红外激光扫描系统Odyssey CLx Infrared Imaging System (Li-Cor公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus IX51)。

NRK-52E细胞用含100 g/L链霉素、100 g/L青霉素及含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基在37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养，细胞生长至亚融合时用1%FBS培养基同步化12 h后开始试验。按不同时间(5，15，30，60 min)分别加入脂多糖(1 μg/ml)刺激；按是否加入处理因素分为5组：正常组、LPS组、TAK-242+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组。

5 μm厚的肾组织冰冻切片经5%牛血清白蛋白37 ℃封闭30 min，TLR4兔多克隆抗体(1:50)4 ℃过夜，FITC标记的山羊IgG (1:100)37 ℃避光孵育90 min，封片后荧光显微镜下观察、照相。

NRK-52E细胞行细胞爬片后，4%多聚甲醛固定细胞，加入TLR4兔多克隆抗体(1:50)，以PBS作为阴性对照，4 ℃避光孵育过夜，加入FITC标记的山羊IgG (1:100)，37 ℃避光孵育45 min后封片，共聚焦显微镜下观察摄像。

预冷PBS轻洗细胞3次，用含有Cocktail (美国Sigma-Aldrich)的细胞裂解液裂解后，4 ℃、13 000 g离心5 min，收集上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取20 μg蛋白，10%SDS-PAGE电泳，电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，一抗工作浓度分别为TLR4兔多克隆抗体(1:1 000)，p38兔多克隆抗体(1:500)、磷酸化(p)-p38兔单克隆抗体(1:500)、JNK兔多克隆抗体(1:500)、磷酸化(p)-JNK兔单克隆抗体(1:500)、β-actin鼠单克隆抗体(1:1 000)，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1:10 000)室温孵育1 h，TBST洗膜，Odyssey红外激光成像系统扫膜，Gel-Pro Analyzer软件分析测量条带的灰度值，以β-actin灰度值为基础，测定各组的相对比值。

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，每组实验均至少重复3次，计量数据以x±s表示，参数资料分析采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P < 0.05视为差异有统计学意义。

免疫荧光结果可见TLR4在肾小管上皮细胞胞质分布，见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠肾小管TLR4的表达与分布(免疫荧光×400) 免疫荧光可见正常组及实验组均存在TLR4的表达，TLR4抗体(红色)，DAPI (蓝色)

共聚焦显微镜下可见NRK-52E细胞表达TLR4蛋白(n=10)，TLR4主要表达于细胞的胞质中。1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞60 min后，共聚焦显微镜下见TLR4蛋白在NRK-52E细胞中的分布无明显变化(n=10)，见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 1 μg/ml脂多糖作用后TLR4蛋白在NRK-52E细胞中的分布(免疫荧光×400) 免疫荧光可见实验组及正常组均存在TLR4的表达，TLR4抗体(绿色)，DAPI (蓝色)

1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞5，30，60 min后，Western blot结果显示60 min组TLR4蛋白表达显著高于5，30 min组(P < 0.05)，见图 3。

图 3(Figure 3)

图 3 1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞不同时间(min)后TLR4蛋白的表达(Western Bolt) 与5，30 min组比较，*P < 0.05

1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞5，15，30，60 min，Western Bolt结果显示，30 min组p38、JNK、Iκ-B磷酸化水平显著高于5，15，60 min组(均P < 0.05)，见图 4。

图 4(Figure 4)

图 4 1 μg/ml脂多糖对NRK-52E细胞MAPK信号通路相关蛋白的影响(Western blot) A：1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞不同时间(min)对MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平的影响(Western blot，n=3)；B：1 μg/ml脂多糖作用NRK-52E细胞不同时间(min)对Iκ-B磷酸化水平的影响(Western blot，n=3)；与5 min组比较，*P < 0.05

脂多糖作用NRK-52E细胞于30 min时p38、JNK、Iκ-B磷酸化水平显著上调，而TAK-242(5 μmol/L)预处理NRK-52E细胞后可使脂多糖诱导的p38、JNK、Iκ-B磷酸化显著降低(均P < 0.05)，见图 5。

图 5(Figure 5)

图 5 TLR4抑制剂对NRK-52E细胞MAPK信号通路相关蛋白的影响(Western blot) A.对照组；B.LPS组；C.TAK-242(5 μmol/L)+LPS组(Western blot，n=3)；与正常组比较，*P < 0.05；与单独LPS刺激组比较，**P < 0.05

与正常NRK-52E细胞相比，脂多糖(1 μg/ml)刺激30 min可使p38、JNK、Iκ-B的磷酸化水平显著增高(P < 0.05)，而SB202190以及SP600125处理后可使其磷酸化水平显著回落(P < 0.05)，见图 6。

图 6(Figure 6)

图 6 MAPK通路抑制剂对NRK-52E细胞Iκ-B蛋白表达的影响(Western blot) 与正常对照组比较(n=3)，*P < 0.05；与单独LPS刺激组比较(n=3)，**P < 0.05

Toll样受体(TLRs)是近年来发现的一类细胞表面信号传导跨膜受体。它广泛存在于固有性免疫系统和适应性免疫系统，提供病原体和生物相互作用界面。目前在哺乳动物体内发现至少有十种Toll样受体，其中TLR4是识别革兰阴性菌胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的主要受体和信号转导分子，在介导LPS的病理生理效应中具有重要作用。

TLR4是Toll样受体家族中研究最为深入的成员之一。蛋白表达分析显示TLR4广泛表达于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞、CD14阳性T细胞、内皮细胞、上皮细胞及CD14阴性T细胞上，在肾脏则表达于肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、肾小球系膜细胞等^[2]。既往研究表明，内毒素诱导的急性肾衰竭依赖于TLR4信号通路的参与。Haake^[4]等研究发现脓毒血症导致的急性肾损伤所释放的内源性物质，主要是LPS，能激活TLR4信号通路，通过NF-κB途径，促使细胞因子、趋化因子释放，最终导致肾脏损伤。

TAK-242是TLR4选择性的抑制剂，能通过结合TLR4胞内区域抑制脂多糖诱导的炎症介质的产生, 同时应用特异性TLR4阻断剂干预可显著降低MAPK信号通路磷酸化水平，据此推测肾小管上皮细胞胞质TLR4的高表达可能参与了LPS诱导的肾小管损伤。本研究结果显示TLR4在肾小管上皮细胞胞质中高表达，且LPS作用后其表达量显著增高，并伴随MAPK信号通路的磷酸化。给予TAK-242可明显抑制LPS诱导的NRK-52E细胞MAPK信号通路磷酸化水平，提示TLR4在LPS诱导肾小管上皮细胞MAPK信号通路的激活中起重要作用。

脂多糖是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，可通过介导p38、JNK MAPK信号通路的激活从而激活肾小管上皮细胞NF-κB，进而诱导多种炎性细胞因子表达增加^[5]。既往研究表明，MAPK信号通路在肾脏疾病的进展中发挥重要作用^[6]。丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族作为一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号转导系统，是细胞内一类重要的跨膜信号转导通路，其主要有4个家族成员：细胞外信号调节的蛋白激酶(ERK)、应激活化的蛋白激酶(JNK)、p38 MAPK和ERK5通路^[7]。Hou^[8]等认为JNK MAPK活化后可上调TNF-α的合成，而TNF-α反过来有促进JNK MAPK的进一步活化，从而形成一个恶性循环，使其效应进一步放大。研究发现，通过采用内毒素休克大鼠模型，抑制p38 MAPK信号通路可以显著降低脓毒症的死亡率^[9]。Wang^[10]等建立小鼠肾动脉硬化的模型，发现抑制p38 MAPK活性可显著改善肾小管萎缩，进而减少肾纤维化的发生。

SB202190是一种特异性的p38 MAPK信号通路抑制剂，通过与p38 ATP中Thr106结合位点结合，竞争性抑制p38 MAPK与ATP结合的能力，从而使其失去活性。SP600125是一种特异性的JNK MAPK信号通路抑制剂，能通过与JNK MAPK竞争ATP结合位点，实现对JNK MAPK激酶的抑制。本研究结果表明，LPS可以提高p38、JNK MAPK的磷酸化水平，特异性抑制剂SB202190、SP600125可通过与p38、JNK MAPK特异性结合，抑制其磷酸化水平，且可以减弱LPS诱导的IκB磷酸化水平，提示p38、JNK MAPK信号转导通路在LPS诱导IκB磷酸化的表达中起着关键作用。

综上所述，本研究发现LPS刺激可诱导肾小管上皮细胞TLR4表达增加，LPS可能通过激活p38、JNK MAPK信号通路参与LPS介导肾小管上皮细胞炎症反应的过程，而TLR4选择性抑制剂TAK-242可抑制这一炎症反应，为临床急性肾损伤的防治提供了新的思路和借鉴。