牙骨质是包绕在牙齿根部的一层特殊的矿化组织，其对牙周结构的形成、发育和再生有重要作用^[1]。在正畸力作用下，牙骨质的抗压性是牙齿移动的可靠保证。适度的正畸力能引起牙槽骨的吸收而不会引起牙骨质的吸收。但事实上，牙骨质往往也有少量的吸收，只是程度轻，范围小并有新形成的牙骨质及时修复，因此难以察觉。成牙骨质细胞的主要功能是形成牙骨质基质。一方面，成牙骨质细胞负责牙骨质基质的沉积和矿化，另一方面，其也能经由细胞分泌物和表面蛋白调控破骨细胞功能。成牙骨质细胞和成骨细胞均为可形成矿化组织的细胞，在细胞形态、功能、分化机制等方面有相似的生物学特性。成骨细胞的功能状态不仅与其分化状态有关，也受凋亡、增殖^[2]和自噬的影响。因此，成牙骨质细胞或许也有类似的生理机制。

信号传导与转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，Stat3)是一种重要的信号蛋白。通过将Stat3磷酸化可以调控下游靶基因，从而影响细胞的增殖和凋亡。Stat3不仅参与了自噬过程，并且对成骨细胞的分化也有重要作用。本实验中，我们成功构建以Stat3为靶点的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒表达载体，在包装产生慢病毒后，感染OCCM-30细胞，筛选获得稳定细胞株，并检测抑制Stat3对OCCM-30分化、凋亡、自噬的作用。

成牙骨质细胞株OCCM-30(由美国华盛顿大学馈赠)；HEK293E细胞(Invitrogen，美国)；DMEM培养基、RPMI 1640培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；PCR引物(上海生工生物公司，中国)；逆转录、qRT-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)；PBS、胰蛋白酶、Trizol (Invitrogen，美国)；异丙醇、无水乙醇、氯仿、细胞培养瓶(NEST，中国); 倒置显微镜(Nikon，日本)；恒温细胞培养箱(Thermo，美国)；NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo，美国)；SYBR荧光定量PCR仪(ABI，美国)。

在培养瓶中接种合适密度且生长状态良好的成牙骨质细胞OCCM-30，加入DMEM培养液(含10% FBS)，并放置于37 ℃，含5%CO₂与95%空气的恒温培养箱，2-3 d换一次液。细胞融合至80%时传代。

小鼠Stat3 shRNA抑制序列由上海吉玛基因有限公司设计，并且与其公司的慢病毒载体质粒pLV3(H1/GFP Puro)相连。该质粒含有H1启动子及绿色荧光蛋白(GFP)编码区与嘌呤霉素(Puro)抗性编码区。总共设计两条抑制序列，分别为siA: 5′-CCCGCCAACAAAUUAAGAA-3，siB: 5′-GGGUCUCGGAAAUUUAACA-3′。两条构建好的质粒分别命名为pLV-stat3-siA和pLV-stat3-siB。阴性对照质粒pLV-NC由吉玛公司赠送。质粒psPAX2和pMD2.G购于美国Addgene公司。

取对数期的293E细胞，充分消化后均匀接种在3个10 cm培养皿中，常规培养。待细胞长至70%融合时，将pLV-stat3-siA/pLV-stat3-siB/pLV-NC分别与psPAX2和pMD2.G按pLV：4.4 μg，psPAX2：7.2 μg，pMD 2.G：3.6 μg的量用Turbofect转染进293 E细胞里面，转染6 h之后换成普通培养液培养，分别在24 h和72 h后收集上清液，用0.45 μm滤器过滤后使用。

取对数期的OCCM-30，充分消化后均匀接种于6孔板中，每孔1×10⁵个细胞，常规方法培养。待细胞长至60%时，吸去培养基，取收集的病毒上清液与普通OCCM-30培养液按1:1混匀后继续培养。6 h之后换成普通培养基，48 h之后开始用每毫升含2 μg的嘌呤霉素筛选，每天进行半量换液，连筛4 d。将筛出的细胞进行传代扩增，分别命名为阴性对照组(NC)，Stat3抑制组A(SiA)，Stat3抑制组B(SiB)，用于下一步试验，并用荧光显微镜拍照，观察GFP情况。

用Trizol溶解收集细胞，并使用酚-氯仿提取各组总RNA。质检合格的RNA样品按照逆转录试剂盒的说明合成cDNA，按照qPCR试剂盒说明书对相关指标进行检测，以GAPDH作为内参。PCR参数：95 ℃ 30 s，经40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)。所有引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 Real-time PCR引物序列 基因 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′) Osterix CCTCTGCGGGACTCAACAAC TGAGGGAAGGGTGGGTAGTC BSP TTTCACTCCAATCGTCCCTACA CTGCCCTTTCCGTTGTTGTC OCN TTTCTGCTCACTCTGCTGACC CAGCACAACTCCTTCCTACCA Stat3 CTGGTGTGAACTACTCAGGGTGT GGGCTTTGTGCTTAGGATGG GAPDH ACCACAGTCCATGCCATCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA

表 1 Real-time PCR引物序列

Western Blot收集细胞，用PBST清洗，并加入适当体积的细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，在冰上裂解25-30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。收集上清液，采用BCA蛋白定量法测蛋白浓度，加相应体积的蛋白上样缓冲液煮沸至完全变性。以10 μl体系在10%SDS-PAGE凝胶上分离，然后转至PVDF膜(70 V，2 h)。在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液孵育1 h，在一抗中(1:1 000)过夜，用TBST洗膜；在二抗(1:10 000)室温孵育2 h，最后用ECL化学发光法显影。

所有实验均独立重复3次。使用GraphPad Prism 5.0统计软件分析数据，用均数±标准差(x±s)表示数据，多组间差异用单因素方差分析法，组间两两比较采用t检验。P＜0.05视为差异有统计学意义。

用慢病毒感染OCCM-30细胞后，细胞生长状态良好。在荧光显微镜下可见阴性对照组，SiA组和SiB组均有明显的GFP。经药物筛选后，GFP表达率可达80%以上(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 荧光显微镜观察OCCM-30中的GFP表达(×100) A-C：GFP显微镜观察；D-F：普通显微镜观察；A、D：SiA实验组；B、E：SiB实验组；C、F：NC阴性对照组

由qPCR结果(图 2)可见，细胞阻断Stat3后，SiB组Stat3的mRNA相对表达量下降，明显低于空白对照组和阴性对照组(P < 0.05)。而SiA组的效果不显著。Western Blot结果显示(图 2)，SiB组Stat3的蛋白表达量较空白对照组和阴性对照组明显下降, 而SiA组的效果不显著。

图 2(Figure 2)

图 2 OCCM-30细胞Stat3 mRNA和蛋白的表达 1：空白对照组；2：阴性对照组；3：SiA组；4：SiB组; 与空白对照组比较，**P < 0.05

Real-time PCR(图 3)结果可见，Stat3通路被阻断后(SiB组)，BSP，OCN，和Osterix的mRNA相对表达量下降，明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05)。这些结果表明，抑制Stat3的表达可以抑制成牙骨质细胞的分化。

图 3(Figure 3)

图 3 OCN，BSP，Osterix mRNA相对表达量 1：空白对照组；2：阴性对照组；3：Stat3抑制组；与空白对照组比较，**P＜0.05

由Western Blot(图 4)结果可见，自噬相关指标Atg-5，Beclin-1的蛋白表达量较空白对照组和阴性对照组均下降，同时，Survivin的蛋白表达量降低，而cleaved caspase-3的表达量增加。

图 4(Figure 4)

图 4 自噬蛋白、抗凋亡蛋白、凋亡蛋白的表达量 1：空白对照组；2：阴性对照组；3：Stat3抑制组

骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)是成骨质细胞的分化标志蛋白，有研究表明在大鼠牙骨质结构中BSP和OPN在牙根发育过程中的表达特征与骨组织相似^[3]。BSP蛋白对矿化沉积起正向调控作用，若BSP功能丧失，会导致骨形成和矿化速率的下降^[4]。OCN在成骨细胞分泌的胞外基质的矿化过程中会表达增加，是骨形成晚期的特异性标志。锌指蛋白osterix是在成骨分化和骨形成过程中起重要作用的转录因子，能够正向调控成牙骨质细胞的分化。有实验结果表明，Stat3与肺纤维细胞的分化有关^[5]，本实验中发现，抑制Stat3后，分化相关指标表达量下降，即表明stat3可能与成牙骨质细胞的分化有关，其具体机制有待研究。

凋亡抑制基因Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员，大部分通过Caspase途径抑制细胞色素C释放从而对凋亡起抑制作用^[6]，caspase分子是一类蛋白水解酶，在凋亡和炎症过程中起着重要作用。活化的caspase分子可以引起细胞凋亡，其中caspase-3是该家族中起关键作用的效应蛋白裂解液。在正畸牙移动的过程中，凋亡对成牙骨质细胞的功能有调控作用，本研究通过抑制Stat3来下调其下游的抗凋亡蛋白survivin，进而使cleaved caspase-3的表达量增加，诱导成牙骨质细胞细胞凋亡。Atg-5和Beclin-1是哺乳动物细胞自噬的标志性基因，并与自噬强度成正相关^[7]。本研究中，抑制Stat3后，自噬相关蛋白表达量降低，表明自噬减弱。

综上，本研究成功构建了Stat3-shRNA慢病毒，并感染成牙骨质细胞，使细胞分化和自噬减弱，凋亡增强，其机制可能跟抑制Stat3信号通路有关。