在全世界范围内，宫颈癌在女性恶性肿瘤发病率中高居第2位，每年新增约471 000例，死亡230 000例^[1]。众所周知，高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生发展的重要致病因素，然而宫颈癌发生发展的分子机制尚未完全明确。

前期研究发现下调叉头框蛋白M1(Fork head BoxM1) FoxM1基因可抑制宫颈癌细胞的增殖^[2]、侵袭、迁移^[3]等。为探究FoxM1调控宫颈癌的机制，进一步实验发现FoxM1可能通过调控基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及血管活性因子VEGF的表达或活性，来促进细胞迁移、基质降解和血管形成，从而参与宫颈癌的侵袭转移^[4]。Shi等^[5]发现Hedgehog信号通路的下游转录因子Gli1可调控FoxM1的转录，并发现FoxM1基因是Hh信号通路的直接转录靶点。而Hh信号通路的激活是通过解除细胞周期的控制，从而促进肿瘤的增殖。本研究拟从宫颈癌组织和宫颈癌细胞两方面探究FoxM1和Gli1的表达、意义及二者相关性。在组织层面上，选取70例宫颈癌组织和10例正常宫颈组织，通过免疫组化分析FoxM1和Gli1的表达，并计算二者的相关性；在细胞层面上，因前期研究^[4]已证实在宫颈癌细胞系中，Hela和Siha中FoxM1表达量显著高于C33A中FoxM1的表达量，且已验证FoxM1与宫颈癌的发生发展相关，故选取高表达FoxM1的Hela和Siha细胞，通过质粒上调及基因沉默下调等技术改变Gli1的表达量，进而检测FoxM1的表达量变化，从而探究FoxM1与Gli1是否有相关性，进一步验证FoxM1是否由Gli1调控从而引发肿瘤的发生发展，为宫颈癌的分子靶向治疗提供理论依据。

80例组织切片由中国西安的AlenaBio生物公司提供。每个切片均由两位病理医师独立阅片并确定其组织学类型和肿瘤分级。组织病理学显示有腺癌4例，鳞癌66例，正常组织10例。70例肿瘤的染色结果显示，Ⅰ期有22例(31.43%)，Ⅱ期有20例(28.57%)，Ⅲ期有28例(40.00%)。按照TNM分期提示44例有淋巴结转移。

所有标本均经过10%甲醛固定，石蜡包埋，制成1.5 μm厚的切片，兔抗人多克隆Gli1抗体(美国圣克鲁兹生物科技公司，sc-20687, 1:100倍稀释)，兔抗人克隆FoxM1抗体(中国Proteintech Group公司，1:150倍稀释)，按免疫组化SP法检测试剂盒说明书进行操作, 然后在光学显微镜下观察(日本Nikon E100)并采集图像。

细胞核或细胞质中出现棕黄色或棕褐色染色者为阳性细胞。根据阳性细胞所占比例评分。0%记0分，1%-10%记1分，11%-50%记2分，51%-80%记3分，＞81%记4分；根据细胞染色强弱评分，无染色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。两者相乘为总评分，总评分0-2分为阴性表达标本，＞2分为阳性表达标本，计算阳性表达率。

Hela细胞由武汉大学中南医院科学研究中心提供，Siha细胞购于中国典型培养物保藏中心。RPMI 1640培养基(GIBCO，美国)；胎牛血清(GIBCO，美国)；超净工作台(苏州净化，中国)；lipo2000转染试剂(Invitrogen，美国)；PCR技术检测试剂盒(Toyobo，日本)；内参β激动蛋白(β-actin)抗体(Santa Cruz, 美国)；总蛋白提取试剂盒(拜意尔生物科技有限公司, 武汉)；FoxM1及β-actin基因引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

该载体名称为：pcDNA3.1，抗性为：Amp+，插入多克隆位点5′HindⅢ-NotⅠ 3′之间。基因全长3 324 bp，该基因扩增使用的引物序列如下：p648，上游：5′-CCCAAGCTTATGTTCAACTCGATGACC-3′p648，下游：5′-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTAGGCACTAGAGTTGAGG -3′该基因使用的测序引物如下：T7(正向通用引物): 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3′。

按照Guo等文献设计并委托武汉转导生物科技发展有限公司合成，Gli1 siRNA的正义序列为: 5′-AACUCCACAGGCAUACAGGAU-3′；阴性对照siRNA序列正义序列为: 5′-AACGUACGCGGAAUACAACGA-3′^[6]。

实验将Hela、Siha细胞分别分为以下5组：Gli1 siRNA组、阴性对照组(阴性siRNA)、Gli1质粒过表达组、空载组(Gli1质粒)、细胞空白对照组。5组细胞均培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。转染方法按脂质体lipofectamine 2000产品说明书进行。转染前1 d换用不加抗生素的培养基培养，待细胞处于对数生长期，接种相同数量细胞接种至6孔板中。当细胞长至40%-60%时进行转染。转染时取5 μl脂质体稀释于250 μl不含血清的Opti-MEMⅠ培养基中，室温静置5 min；取8 μl RNAi溶液稀释于250 μl无血清的Opti-MEM Ⅰ培养基中；将上述两种稀释液混合均匀，室温静置20 min。将6孔板中细胞培养基更换1.5 ml新鲜无血清的RPMI 1640培养基，将上述混悬液分别加入到6孔板中，转染6 h后更换为2 ml完全培养液继续培养。

Hela、Siha细胞转染后24 h，用TRIzol提取其总RNA，RT合成cDNA。PCR扩增按照PCR技术检测试剂盒说明书进行。Gli1基因特定的RT-PCR引物序列上游：5′-TCCAGCTAGAGTCCAGAGGT-3′, 下游: 5′-TGGCTTGACTTGCACTTGTC-3′。FoxM1基因特定的RT-PCR引物序列上游: 5′-AGGATTCGTCCCAATCTCCC-3′，下游: 5′-AAGGGAGTGGTGCTGAGATC-3′。每个样品设3个复孔，反应体系总体积为25 μl，反应条件：95.0 ℃ 10 s，55.0 ℃ 20 s，72.0 ℃ 20 s，75.0 ℃ 5 s，共40个循环。结果以Hela和Siha细胞FoxMl mRNA与β-actin mRNA的相对表达水平表示，实验重复3次。以公式2^-ΔΔCT(CT为循环阈值)计算目的基因mRNA的表达水平。

使用美国微软公司SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料的数据用均数±标准差表示，组间比较使用t检验。比较2组以上，方差齐时用单因素方差分析，方差不齐时用Kruskal-Wallis。双变量相关性分析采用Spearman秩相关。P＜0.05提示数据有统计学意义。

见表 1。肿瘤病人的年龄为15-72岁，中位年龄是44岁。肿瘤样本依据年龄被分成3组(≤40岁, 41-55岁，以及≥56岁)。2种蛋白的表达在宫颈癌组织中均显著高于正常宫颈组织(P＜0.05)(表 2)。

表 1(Table 1)

表 1 70例肿瘤组织的临床病理特点[n(%)] 类别 鳞癌(n=4，5.00) 腺癌(n=66，82.50) 分化程度  高分化 0 4 (6.06)  中分化 3(75.00) 40(60.61)  低分化 0 19(28.79)  未明确 1(25.00) 3(4.54) 宫旁转移  无 1(25.00) 31(46.97)  有 3(75.00) 35(53.03) 淋巴结转移  无 3(75.00) 41(62.12)  有 0 24(36.36)  不明确 1 (25.00) 1(1.52) 年龄(岁)  ≤40 2(50.00) 18(27.27)  41-55 1(25.00) 40(60.61)  ≥56 1(25.00) 8(12.12)

表 1 70例肿瘤组织的临床病理特点[n(%)]

表 2(Table 2)

表 2 Gli1和FoxM1在宫颈癌组织和正常宫颈组织中表达 指标 鳞癌 腺癌 Pc OD (x±s)(×105) Pa OD (x±s)(×105) Pb FoxM1 2.270±1.640 < 0.001* 1.390±1.170 0.014* 0.34 Gli1 1.330±0.959 < 0.001* 1.410±0.732 0.014* 0.62 a鳞状癌细胞与正常组织对比，b腺癌细胞与正常组织对比，c鳞状癌细胞与腺癌细胞对比，P＜0.05

表 2 Gli1和FoxM1在宫颈癌组织和正常宫颈组织中表达

FoxM1蛋白在阳性细胞质和细胞核中染成棕色颗粒，且核深染(图 1)。表 3显示FoxM1在宫颈癌组织中的表达。其在宫颈癌组织中表达显著高于正常组织[光密度OD值(2.97±1.67)×10⁴]。FoxM1的表达与宫颈癌的侵袭程度有关(P=0.011)，在小于41岁与大于55岁年龄组间其表达有统计学意义(P=0.033)。但数据分析结果显示，FoxM1的表达与宫颈癌的分化程度未见统计学差异(P=0.512)，FoxM1表达与宫颈癌的淋巴转移无关(P=0.408)。Spearman秩相关检验提示FoxM1与Gli1相关系数r=0.405(P＜0.001)。

图 1(Figure 1)

图 1 FoxM1在宫颈癌组织中过表达 FoxM1在腺癌(B)过表达，鳞癌(C、D)过表达以及在正常宫颈组织(A)中阴性表达。FoxM1在宫颈癌细胞中细胞质(红箭头示)和细胞核(蓝箭头示)均表达(×100)。右下角框内以更高放大倍数显示免疫染色的亚细胞定位(放大原始物体4倍)

表 3(Table 3)

表 3 FoxM1在宫颈癌与正常宫颈组织中的表达 类别 n(%) OD (x±s)(×105) P 病理阶段  高分化 48(68.57) 2.180±0.172 0.512  低分化 19(27.14) 2.480±1.450 侵袭程度△  Ⅰ期 22(31.43) 1.540±1.490  Ⅱ期 20(28.57) 2.340±1.360 0.011*  Ⅲ期 28(40.00) 2.710±1.750 淋巴结转移  N0 44(62.86) 2.090±1.600 0.408  N1 24(34.29) 2.440±1.720 年龄(岁)  ≤40 20(28.57) 2.720±1.710  41-55 41(58.57) 2.200±1.630 0.033*  ≥56 9(12.86) 1.330±0.985 *P < 0.05提示数据有统计学意义；△根据AJCC分类

表 3 FoxM1在宫颈癌与正常宫颈组织中的表达

免疫组化着色结果显示Gli1在细胞质和细胞核中均表达(图 2)。表 4显示Gli1在宫颈癌组织中的表达。Gli1在分化程度高的宫颈癌组织中表达较低(P=0.022)。此外，Gli1的表达与宫颈癌的侵袭程度有关(P=0.005)，Gli1在有淋巴结转移组织中表达更高(P=0.017)。

图 2(Figure 2)

图 2 Gli1在宫颈癌组织中过表达 Gli1蛋白在腺癌(B)过表达，鳞癌(C、D)过表达以及在正常宫颈组织(A)中阴性表达。Gli1在宫颈癌细胞中细胞质(蓝箭头示)和细胞核(黑箭头示)均表达(×400)

表 4(Table 4)

表 4 Gli1在宫颈癌与正常宫颈组织中的表达 类别 n(%) OD (x±s)(×105) Pa 病理阶段  高分化 48(68.57) 1.180±0.944 0.022*b  低分化 19(27.14) 1.770+0.903 侵袭程度c  Ⅰ期 22(31.43) 0.889±0.687  Ⅱ期 20(28.57) 1.330±0.532 0.005*d  Ⅲ期 28(40.00) 1.690±1.200 淋巴结转移  N0 44(62.86) 1.150±0.730 0.017*b  N1 24(34.29) 1.720±1.200 年龄(岁)  ≤40 20(28.57) 1.250±0.887  41-55 41(58.57) 1.360±1.010 无区别  ≥56 9(12.86) 1.420±0.844 aP < 0.05提示数据有统计学意义; b:独立样本t检验; c根据AJCC分类; d方差不相等，Kruskal-Wallis测试

表 4 Gli1在宫颈癌与正常宫颈组织中的表达

在Hela细胞中，转染Gli1siRNA后，FoxM1 mRNA的表达量显著降低(P < 0.05)；导入Gli1质粒后，FoxM1 mRNA的表达量显著升高(P < 0.05)(图 3、4)。同样，在Siha细胞中，转染Gli1siRNA后，FoxM1 mRNA的表达量显著降低(P < 0.05)，导入Gli1质粒后，FoxM1 mRNA的表达量显著升高(P < 0.05)(图 5, 6)。

图 3(Figure 3)

图 3 在Hela细胞中下调Gli1后，FoxM1 mRNA表达量随之降低

图 4(Figure 4)

图 4 在Hela细胞中上调Gli1后，FoxM1 mRNA表达量随之增加

图 5(Figure 5)

图 5 在Siha细胞中下调Gli1后，FoxM1 mRNA表达量随之降低

图 6(Figure 6)

图 6 在Siha细胞中上调Gli1后，FoxM1 mRNA表达量随之增加

经典的哺乳动物Hedgehog信号通路是由Hh配体、跨膜蛋白质受体patched (Ptch1和Ptch2)和Smoothened (Smo)组成的受体复合物、下游转录因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)等组成。已有研究猜测FoxM1可能为Gli1的下游靶基因，我们前期实验已证实FoxM1参与宫颈癌的发生发展过程，因而明确Gli1是否通过Hh信号通路的下游靶点FoxM1参与宫颈癌有重要作用。

FoxM1从属于叉头框蛋白家族，是一类DNA结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。FoxM1主要通过对细胞周期的调控来刺激细胞增生和有丝分裂的进行^[7]，在胚胎发育、组织再生过程中起重要作用。FoxM1的激活是一个多因子、多细胞信号通路共同参与的复杂过程，其中主要包括Ras-MAPK信号通路和Hh信号通路^[8]。Calvisi等^[9]的研究发现，沉默Gli1基因会导致蛋白水平中等程度降低，且会大大降低FoxM1的表达水平。表明Gli1和FoxM1在肿瘤发生中可能存在一定关系。

Gli1作为一个转录激活因子，其表达被当作是Hedgehog信号通路激活的标志^[10]。Gli1已被证实在多种肿瘤中高表达，并可能与多种肿瘤的发生发展和侵袭转移相关^[11]。有文献报道，Gli1在宫颈癌中高表达，并参与调控肿瘤的增殖和侵袭转移^[12]。另有研究表明FoxM1作为Gli1因子的一个下游作用分子，受Hedgehog信号通路的调控^[13]，在恶性神经胶质细胞瘤中抑制Gli1的表达后FoxM1表达下调，在非小细胞肺癌中FoxM1的表达与Gli1因子的表达也有明显的相关性。

在宫颈癌组织中，FoxM1和Gli1均过表达。FoxM1与肿瘤的侵袭相关(P=0.011)，FoxM1表达与病理分级以及淋巴转移均未显示相关性。然而，FoxM1表达在55岁以上的患者较41岁以下患者中更低(P=0.033)。这项结果表明FoxM1表达随年龄而降低。FoxM1和Gli1的表达均与宫颈癌临床分期相关，而只有Gli1与肿瘤病理分级相关。但因本实验取用宫颈组织有限，故实验结果准确性可能有所欠缺。

在宫颈癌细胞系Hela、Siha中，下调Gli1后，FoxM1 mRNA表达量明显减少，导入过表达Gli1质粒后，FoxM1 mRNA表达量明显增多。由此推断，当Hh信号通路激活后, Gli1可能通过调控下游转录因子FoxM1来调控宫颈癌的发生发展，另实验中还发现Gli1和FoxM1的表达虽呈显著正相关，但不是线性相关，这使得我们猜测FoxM1的表达不仅受Gli1这一基因的调控，其表达可能是多通路相互共同作用的结果。后续试验可进一步探究Gli1调控FoxM1的基因位点，在基因水平为宫颈癌的分子靶向治疗寻求新的突破。