小肠移植是治疗肠功能衰竭的有效治疗手段，脑死亡供体已成为小肠移植的重要来源^{[1, 2]}。但脑死亡可引起器官损伤^[3]，造成移植小肠慢性失功，从而严重制约小肠移植事业的发展。研究报道，细胞凋亡可能是引起脑死亡器官损伤的关键因素之一^[4]。Bax和Caspase3是重要的凋亡相关基因，在细胞凋亡通路中促进凋亡的发生。另有研究证明，巴马小型猪脑死亡状态下小肠损伤重要指标蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)表达水平明显升高^[5]。本文拟建立家兔脑死亡模型，探究脑死亡状态下家兔小肠细胞中PKC及其凋亡相关基因表达的关系。

健康成年雄性家兔60只，12-16周龄，体质量(2.9±0.3)kg，购于武汉万千佳禾实验动物养殖中心，SPF级，饲养温度：20-25 ℃，湿度：50%-70%，标准饮食，实验动物许可证号：SCXK(鄂)2007-0006。

HX-100E动物呼吸机、JR-1/2智能恒温控制仪、BL-420生物机能实验系统均为成都泰盟科技有限公司产品，多功能心电监护仪(美国惠普公司), RevertAid^TM逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)，抗PKC、NF-κB、Caspase3一抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(SC-2005)(美国Santa Cruz公司)。

60只家兔随机平均分为2组。根据脑死亡时间点设计要求，再分为2, 6和8 h组(每组10只)。假手术组：行麻醉术，气管插管，股动脉插管和颅骨钻孔置管术，不进行颅内加压；脑死亡组：行麻醉术，气管插管，股动静脉插管，颅骨钻孔置管术及颅内加压脑死亡术。每小组分别在脑死亡后2, 6和8 h取小肠组织标本，根据不同实验要求分别进行甲醛浸泡和-80 ℃保存。

参照美国神经病学会于1995年提出的脑死亡实践诊断标准，本实验的死亡标准：①深昏迷，排除麻醉、低体温等可逆性昏迷；②脑干反射消失，包括瞳孔对光反射、角膜反射等；③自主呼吸停止，依赖呼吸机维持；④脑电图静息，并持续30 min以上。

脑死亡模型建立：家兔术前禁食12 h，称重，戊巴比妥剂量按500 mg/kg计算，经耳缘静脉麻醉。将家兔固定，备皮，行股动脉插管，接压力换能器，同侧行股静脉插管，接微量注射泵；同时行气管插管术，待自主呼吸停止时，接微型呼吸机，给予通气支持；再行颅骨钻孔置管术，向气囊导管中缓慢注入生理盐水持续加压，密切观察脑电图，动脉压等相关指标变化。当生命体征符合本实验脑死亡标准时，即脑死亡模型建立。

用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，水化。分别用苏木精、伊红双染5 min，脱水，封固。在显微镜下观察小肠损伤情况。

取两组小肠组织标本进行甲醛固定，石蜡包埋，脱蜡，水化。用30 ml/L过氧化氢-甲醇溶液灭活内源性过氧化氢酶，室温孵育5 min，微波修复抗原。加一抗(1:1 000，抗PKC、NF-κB、Caspase3一抗)后4 ℃孵育过夜，加二抗(1:5 000，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗)37 ℃处理1 h，TBST冲洗3次，DAB显色，苏木素脱染，脱水，封固。显微镜观察到含有黄色颗粒者是阳性细胞。计算5个高倍镜视野下阳性细胞率(阳性细胞率=阳性细胞/总细胞×100%)，并求出均数作为PKC的蛋白表达量。每张切片在×400视野下随机选取3个不同视野并拍照，一起分析出相应积分吸光度值，并求出平均值作为Caspase3及NF-κB的蛋白表达量。

在研钵中将冻存组织研磨为匀浆，Trizol法提取其中的总RNA。用RevertAid^TM逆转录试剂盒得cDNA后，进行PCR扩增。PCR扩增引物序列：GAPDH F：5′-TCTG-GCAAAGTGGATGTTGTC-3′ R：5′-TCACGCC CATCACAAACAT-3′；Bax F：5′-TCAGGGTTTC ATCCAGGACC-3′; R：5′-TGATGAGCTCAGGC ACCTTG-3′。2%琼脂凝胶电泳检测PCR产物，再用Image软件分别进行2种指标的灰度值计算及分析。

利用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，灰度值采用均数±标准差表示。采用ANOVA方差分析进行统计处理，P＜0.05表示有统计学意义。

图 1(Figure 1)

图 1 两组家兔小肠组织HE染色情况(HE×100) A，B，C示假手术组2, 6, 8 h的染色情况；D，E，F示脑死亡组2, 6, 8 h的染色情况

假手术组绒毛排列整齐，血管周围结构正常，无明显出血，基底层正常, 仅有少数炎性细胞浸润。脑死亡组2 h绒毛结构完整性破环较轻，黏膜肿胀不明显，可见炎性细胞浸润；随脑死亡时间延长，绒毛缺损程度加重，变短变细，黏膜明显肿胀充血，部分黏膜脱落，基底层断裂，并可见红细胞和炎性细胞聚集。与6 h肠组织情况相比，术后8 h小肠组织损伤更严重。

假手术组小肠组织中Caspase3，PKC，NF-κB蛋白表达于胞质中，仅见少量阳性细胞，各时间点均无明显差异(P>0.05)；脑死亡组与假手术组比较，各时间点小肠组织中三种蛋白表达均显著增高(P＜0.05)；且随脑死亡时间延长，三种蛋白表达量呈增加趋势，有明显的差异(P＜0.05)，8 h均达到最高量(见图 2-4)。

图 2(Figure 2)

图 2 小肠组织Caspase3蛋白表达情况(× 400) A，B，C示假手术组2, 6, 8 h的蛋白表达情况；D，E，F示脑死亡组2, 6, 8 h的蛋白表达情况

图 3(Figure 3)

图 3 小肠组织PKC蛋白表达情况(× 400) A，B，C示假手术组2, 6, 8 h的蛋白表达情况；D，E，F示脑死亡组2, 6, 8 h的蛋白表达情况

图 4(Figure 4)

图 4 小肠组织NF-κB蛋白表达情况(× 400) A，B，C示假手术组2, 6, 8 h的蛋白表达情况；D，E，F示脑死亡组2, 6, 8 h的蛋白表达情况

图 5(Figure 5)

图 5 RT-PCR法测定Bax mRNA表达情况 与假手术组比较，△P＜0.05；与同一组前一时间点比较，*P＜0.05 A:假手术组和脑死亡组Bax mRNA电泳结果(GAPDH为内参); B: Bax mRNA在两组中的相对表达量

通过RT-PCR检测，脑死亡组的Bax mRNA在各时间点均表达，且表达水平呈增加趋势，差异具有显著性意义(P＜0.05)。

前期研究证明，脑死亡状态致血流动力学、激素、代谢和炎症等改变，严重影响器官移植质量及近远期疗效^{[6, 7]}。本实验通过建立家兔脑死亡模型，模拟临床脑死亡供者，以此探究其具体损伤机制。

HE染色实验中，脑死亡6和8 h后，小肠绒毛结构完整性严重破坏，黏膜脱落，肿胀出血，基底部断裂，伴有炎性细胞大量浸润，但假手术组尚未见明显损伤。由此，我们可以推测，脑死亡状态6-8 h可导致小肠结构明显损伤。

PKC是磷脂依赖钙激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，在传递细胞信号的多种通路中发挥重要作用。大量文献报道，PKC和NF-κB是反映细胞信号调控的重要指标^{[9, 10]}。PKC常规参与细胞增殖、凋亡、肿瘤发生等过程^[9]。活化PKC通过降解NF-κB与抑制因子结合的无活性分子，从而激活NF-κB，进入细胞核整合DNA并启动或抑制靶基因转录。本研究中，脑死亡组PKC和NF-κB在蛋白表达量均高于假手术组，并随着时间延长而增高，提示该两信号蛋白参与脑死亡致小肠损伤的病理过程。

细胞凋亡是一个受内在因素(如DNA损伤)或外在因素(如生长因子、类固醇激素)作用而启动的生理过程^[11]。Caspase3是细胞凋亡效应的执行分子，同时还可以调节上游基因，促进细胞凋亡^{[11, 12]}。Bax是内在凋亡通路中的主要效应物之一^[13]，Bax激活后，线粒体外膜寡聚化形成大量释放细胞色素的毛孔，使线粒体肿胀透化，引起细胞凋亡^[14]。脑死亡组Caspase3和Bax表达量远高于假手术组，并随时间延长显著增加，且与PKC和NF-κB表达趋势一致。由此，我们认为，脑死亡致小肠损伤与肠细胞的凋亡过程相关，且可能通过PKC和NF-κB信号途径实现，该研究将为评估脑死亡供体移植小肠的质量评估提供新的实验依据。