巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是最常见的宫内感染病毒之一。据调查，欧美国家的CMV宫内感染活产儿约0.64%-0.7%, 我国约6.97%的大城市孕妇属于CMV活动性感染，其中，CMV宫内感染活产儿约37.32%^{[1, 2]}。CMV宫内感染活产儿的神经系统发育落后，并呈渐进性恶化，是人类学习记忆能力下降的第2位原因^{[3, 4]}。但是，CMV宫内感染对子代学习记忆的影响机制仍不明确。

学习记忆能力与神经元的Tau蛋白磷酸化密切相关^[5]。细胞内蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)和蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A)是Tau蛋白磷酸化最重要的蛋白酶^[6]。为此，本文通过建立豚鼠CMV宫内感染动物模型，观察CMV宫内感染对子代海马神经元Tau蛋白磷酸化的影响，探讨CMV宫内感染的子代学习记忆能力下降的影响机制，报告如下。

豚鼠巨细胞病毒(guinea pig cytomegalovirus, GPCMV)标准株22122和豚鼠胚肺细胞株均购自美国典型培养物保藏中心(American type culture collection, ATCC)，按常规方法在武汉大学中南医院医学科学研究中心培养传代，病毒半数组织培养感染量(tissue culture infectious dose, TCID₅₀)为10^-4.58。

60只雌性及15只雄性Hartley豚鼠体重(450±25) g，月龄＞6个月(湖北省医学实验动物中心提供)[许可证编号：SCXK (鄂) 2010-0008]。所有实验动物的操作及饲养均符合“The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals”的规定^[7]。应用PCR法筛选豚鼠外周血的GPCMV DNA阴性者列为研究对象。按4:1比例将雌雄豚鼠同笼受孕，次日晨检查雌性豚鼠阴道分泌物，发现精子之日确定为受孕0 d。随机选择孕早期(孕龄1-20 d)豚鼠分为2组：感染组25只, 每只腹腔内接种GPCMV病毒悬液(1×10⁷ TCID₅₀) 1 ml, 足月分娩后，应用PCR法检测子代豚鼠外周血的GPCMV DNA，DNA阳性者喂养至3月龄后脊椎脱臼法处死，无菌采集脑组织后分离出海马区，部分4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，剩余冻存于-80 ℃待用; 对照组25只, 每只腹腔内接种生理盐水1 ml，方法同感染组。

兔抗PKA多克隆抗体; 兔抗PP2A多克隆抗体，山羊抗p-Tau (Ser404)多克隆抗体，山羊抗Tau多克隆抗体均购自Sigma Cruz公司，过氧化物酶标记兔抗山羊IgG, 过氧化物酶标记羊抗兔IgG和即用型SABC-AP试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购于碧云天生物技术公司，其他试剂购自武汉谷歌生物科技有限公司。

石蜡切片常规脱蜡至水，用3% H₂O₂灭活内源性酶15 min, PBS洗3次，每次3 min; 将切片浸入0.02 mol/L PBS枸橼酸缓冲液中微波加热至沸腾，放置室温冷却后，依次滴加血清封闭液37 ℃孵育30 min，一抗湿盒中4 ℃孵育过夜(稀释度1:150)，生物素标二抗常温孵育2 h (稀释度1:100)，SABC复合物常温孵育45 min，最后DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒显色15 min，苏木精复染10 s，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封片。光镜下随机选取海马CA1区5-8个视野，观察并采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行平均光密度(absorbance，OD)值检测。

BCA试剂盒测定提取的总蛋白浓度后，计算上样量，加入5×SDS上样缓冲液至1倍浓度，沸水中加热10 min使蛋白变性，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%-15%分离胶)电泳分离至溴酚蓝抵达分离胶下缘; 切胶后，分离的蛋白在250 mA，冰浴条件下转膜120 min, 将目的蛋白转移到NC膜; TBST洗膜后，室温下依次置入5%脱脂奶粉封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜(稀释度1:1 000)，过氧化物酶标记的二抗孵育2 h (稀释度1:2 000)，TBST洗涤2次，每次10 min，最后TBS洗涤1次，10 min，用ECL化学发光、显影及定影; GIS1000分析软件/图像分析系统对蛋白条带进行分析，统计并分析目的蛋白与β-actin条带光密度值的比值。

应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

应用免疫组织化学法检测CMV宫内感染对子代豚鼠海马组织Tau、p-Tau (Ser 404)、PP2A及PKA蛋白表达的影响。由图 1可见，Tau、p-Tau (Ser 404)、PP2A及PKA蛋白棕色阳性信号主要位于细胞质。对照组神经元形态完整，轴突结构明显，而感染组神经元细胞破裂，排列疏松，着色深浅不均，结构欠完整。

图 1(Figure 1)

图 1 免疫组织化学法检测CMV宫内感染对子代豚鼠海马神经元Tau相关蛋白表达的影响(×400) A、B、C、D分别为两组子代豚鼠海马神经元Tau、p-Tau (Ser404)、PP2A及PKA蛋白的表达; E为两组子代豚鼠海马神经元Tau相关蛋白表达水平比较(与对照组相比，*P＜0.01)

应用免疫印迹法进一步检测CMV宫内感染对子代豚鼠海马组织Tau、p-Tau (Ser 404)、PP2A及PKA蛋白表达的影响，结果如图 2。CMV宫内感染导致子代豚鼠海马神经元Tau、p-Tau (Ser 404)及PKA蛋白表达水平增加，而PP2A蛋白的表达水平降低。

图 2(Figure 2)

图 2 免疫印迹法检测CMV宫内感染对子代豚鼠海马神经元Tau相关蛋白表达的影响 A、B、C、D分别为两组子代豚鼠海马神经元Tau、p-Tau (Ser404)、PP2A及PKA蛋白的表达; E为两组子代豚鼠海马神经元Tau相关蛋白表达水平比较(与对照组相比，*P＜0.01)

CMV是一种嗜神经病毒，易感染脑组织，受感染细胞主要分布于大脑皮质和海马^[8]，而大脑皮质和海马的神经元是学习记忆能力最重要的结构基础。前期研究发现，CMV宫内感染导致子代海马神经元病理改变(细胞结构紊乱，出现坏死、凋亡等)和功能改变(NMDA受体，PKC蛋白，突触数目及相关蛋白等)，这可能是CMV宫内感染的子代学习记忆下降的原因之一^[9-11]，但是，具体作用机制仍不清楚。

Tau蛋白主要位于神经元轴突，是一种含量最高的微管相关蛋白(microtubule associated proteins，MAPs)，通过与微管蛋白结合形成微管，并且与形成的微管相互结合，维持微管的完整性和稳定性^[12]。正常人大脑中，Tau蛋白处于一种低水平的磷酸化状态(含2-3个磷酸基)。但是，当Tau蛋白过度表达或异常磷酸化后，其与微管结合性减弱，使得微管稳定性下降，轴浆运输功能受损，神经原纤维缠结聚积，最终导致学习记忆功能受损^[13]。据统计，目前已发现85种以上的Tau蛋白磷酸化位点，尤其是Ser396、Ser404、Ser199/202、Thr231和Thr 181等位点，与学习记忆能力均密切相关^[14]。因此，本文应用免疫组织化学和免疫印迹法检测CMV宫内感染的子代豚鼠海马神经元Tau相关蛋白的表达水平变化，结果显示，CMV宫内感染的子代豚鼠海马神经元Tau及p-Tau (Ser404)蛋白的表达水平上升，提示CMV宫内感染的子代学习记忆能力下降，可能与上调海马神经元Tau和Tau Ser404磷酸化位点的蛋白水平相关。

Tau蛋白磷酸化水平主要取决于体内多种蛋白激酶(催化磷酸化反应)和蛋白磷酸酶(去催化去磷酸化反应)的相互作用。正常情况下，两者处于一种动态的平衡。当机体存在氧化应激、金属离子、炎症及内源性甲醛等刺激时，神经元中的蛋白激酶活性增高或/和蛋白磷酸酶活性降低，将引起Tau蛋白磷酸化水平异常增高^{[15, 16]}。根据不同的作用部位，蛋白激酶可分为三种：脯氨酸蛋白激酶，非脯氨酸蛋白激酶及酪氨酸特异蛋白激酶。PKA属于非脯氨酸蛋白激酶，它不仅直接磷酸化Tau蛋白的多个位点，而且其对Tau蛋白的预磷酸化可使GSK-3β对Tau蛋白的磷酸化作用大大增强^{[17, 18]}。在Tau蛋白磷酸化过程中，PP2A是活性最强的蛋白磷酸酶，可促使异常磷酸化的Tau蛋白去磷酸化、解除轴突运输障碍，恢复Tau蛋白的生物学功能^[19]。研究发现，PP2A抑制剂引起大鼠海马神经元突触、树突丢失及Tau蛋白异常磷酸化，而叶酸、维生素B₁₂及黄连素等药物增加PP2A活性，从而降低Tau蛋白磷酸化水平，改善学习记忆能力^{[20, 21]}。本文应用免疫组织化学和免疫印迹法检测CMV宫内感染的子代豚鼠海马神经元中的蛋白酶表达水平的变化，结果显示，CMV宫内感染的子代豚鼠神经元中的PKA蛋白的表达水平上升，而PP2A蛋白的表达水平下降，提示CMV宫内感染的子代Tau及Tau Ser404磷酸化位点的蛋白表达水平增加，可能与同时上调神经元中PKA蛋白的表达和下调PP2A蛋白的表达相关。

我们推断，CMV宫内感染的子代海马神经元中PKA蛋白的表达上升和PP2A蛋白的表达下降，促使Tau及Tau Ser404磷酸化位点的蛋白表达水平增加，从而导致子代学习记忆能力下降。当然，其作用机制有待进一步研究。