最新研究表明^[1]，慢性肾衰状态下，肠道对毒素的清除能力与疾病的发展过程关系密切。微血管密度(microvessel density，MVD) 变化是肠道血流变化的重要指标。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是微血管生成的主要调节因子之一，在体内表现出强大的促血管生成作用，其他因子的血管生成作用大多需要通过VEGF的表达来实现。有专家认为^[2]，VEGF和MVD可以作为与小肠血管内皮增生和大量微血管网有关，其变化可以影响小肠血流量和血管阻力，影响毒素的肠道排出。基于以上理论，我们利用不同药物对肾衰模型大鼠VEGF和MVD进行比较，并对其胃肠道清除尿毒素能力进行分析，从而为慢性肾衰的无创化治疗提供思路。

雄性SD大鼠50只，均来自复旦大学医学院实验动物中心，体重180-220 g，按体重随机数字法随机分为5组，模型组、假手术组(对照组)、吲哚美辛组，盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组，每组10只，5组大鼠均给予同样的喂养和食物，具有良好的可比性(P>0.05)。

盐酸川芎嗪片(西安力邦制药有限公司)；吲哚美辛(石药集团欧意药业有限公司)；盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司)；DG3022A型酶标仪；美国GeneQuant Pro紫外线微量分光光度仪；VEGF多克隆抗体(美国Sigma公司)；CD141单克隆抗体(瑞典NeoMarkers公司)；VEGF、CD141免疫组化试剂盒。

模型组动物以3%戊巴比妥钠麻醉，常规消毒后左腹部开口，打开腹腔，以5/6肾脏切除法制备肾衰模型，1周后取尾静脉血进行肌酐(Cr)、尿素氮(BUN) 测定，确定模型建立成功。假手术组仅行麻醉、肾包膜剥离及肾脏暴露，不进行肾脏切除。给药剂量：吲哚美辛组2 mg/(kg·d)；盐酸川芎嗪150 mg/(kg·d)；盐酸贝那普利组10 mg/(kg·d)。将药剂磨成粉末，以生理盐水稀释至2 ml灌胃。模型组和对照组以省流量盐酸2 ml灌胃，连续8周。

灌药8周后留取大鼠粪便，进行肌酐和BUN含硫量测定；对5组大鼠腹腔麻醉，心脏采血并分离小肠黏膜。利用多功能生化分析仪测定血肌酐、尿素氮；小肠VEGF测定采用ABC免疫组化法进行；MVD测定采用免疫组化PV二步法进行。

VEGF测定：标本10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，VEGF免疫组化染色，以PIPS-2020病理图文分析系统进行VEGF蛋白表达的定量分析，并根据免疫组化定量公式计算阳性反应程度的阳性单位(PU)。

MVD测定：免疫组化PV二步法测定标本CD141阳性微血管密度后，每个标本查看50个视野，计数CD141阳性毛细血管腔个数，求得MVD=CD141(+) 毛细血管腔个数/小肠横切面积。

采用SPSS 19.0软件包分析，组间比较采用ANOVA方差分析，如果方差分析具有统计学意义则以SNK-q检验进行事后分析；各指标相关性分析采用Pearson相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

假手术组大鼠皮毛致密，活动正常；模型组精神萎靡，皮毛蓬松，活动迟缓；实验结束后吲哚美辛组、盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组体重明显高于模型组(P < 0.05)；实验结束后模型组、吲哚美辛组、盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组各有1只大鼠死亡。

灌胃8周后，模型组、吲哚美辛组、盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组血、粪Cr、BUN均高于假手术组，差异具有统计学意义(P < 0.05)；盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组血Cr、BUN，粪Cr均低于于模型组，粪BUN高于模型组，差异具有统计学意义(P < 0.05)；吲哚美辛组血Cr、BUN与模型组差异无统计学意义(P>0.05)，粪Cr、BUN与模型组差异具有统计学意义(P < 0.05)；盐酸川芎嗪和盐酸贝那普利血Cr、粪Cr、BUN与吲哚美辛组差异具有统计学意义(P < 0.05)；盐酸贝那普利组与盐酸川芎嗪组血Cr、BUN，粪Cr差异具有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠血、粪Cr、BUN检测结果 组别 粪 血 Cr (μmol/L) BUN (μmol/L) Cr (μmol/L) BUN (mmol/L) 假手术组 35.64±7.51 1.74±0.64 33.41±8.45 7.26±1.24 模型组 88.54±12.63a 3.24±1.14a 83.06±27.41a 18.96±4.61a 吲哚美辛组 74.15±7.69ab 4.51±4.65ab 81.84±11.04a 17.25±7.15a 盐酸川芎嗪组 62.15±12.45abc 2.11±0.95abc 55.34±10.32abc 15.63±7.15abc 盐酸贝那普利 71.13±10.26abcd 1.99±1.21abc 69.12±9.33abcd 12.21±4.51abd 与假手术组相比，aP < 0.05；与模型组相比，bP < 0.05；与吲哚美辛组相比，cP < 0.05；与盐酸川芎嗪组相比，dP < 0.05

表 1 各组大鼠血、粪Cr、BUN检测结果

VEGF及CD141在小肠表达的照片见图 1和图 2。与假手术组相比，其他各组VEGF和MVD阳性表达均明显减弱(P < 0.05)；与模型组相比，盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组VEGF和MVD阳性表达增强(P < 0.05)，吲哚美辛组表达降低(P < 0.05)；盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组与吲哚美辛组组VEGF表达差异有统计学意义(P < 0.05)；盐酸川芎嗪组和盐酸贝那普利组MVD差异具有统计学意义(P < 0.05)，但VEGF差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠小肠黏膜VEGF染色图片(SABC×400) A.假手术组；B.模型组；C.吲哚美辛组；D.盐酸川芎嗪组；E.盐酸贝那普利组

图 2(Figure 2)

图 2 各组大鼠小肠黏膜CD141染色图片(SABC×400) A.假手术组；B.模型组；C.吲哚美辛组；D.盐酸川芎嗪组；E.盐酸贝那普利组

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠小肠VEGF、MVD比较 组别 VEGF (pU) MVD (个/mm2) 假手术组 21.41±10.26 46.54±14.56 模型组 10.18±14.28a 21.69±15.62a 吲哚美辛组 8.61±7.85ab 15.41±56.14ab 盐酸川芎嗪组 16.98±11.54abc 42.15±15.62abc 盐酸贝那普利 18.15±7.54abc 41.24±24.68abcd 与假手术组相比，aP < 0.05；与模型组相比，bP < 0.05；与吲哚美辛组相比，cP < 0.05；与盐酸川芎嗪组相比，dP < 0.05

表 2 各组大鼠小肠VEGF、MVD比较

经Pearson相关性分析发现，肾脏VEGF和MVD具有显著相关性(r=0.845，P < 0.05)。

经Pearson相关性分析发现，肾脏VEGF和MVD与血BUN具有负性相关关系，与粪Cr、粪BUN具有正性相关关系(P < 0.05)。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 肾脏VEGF和MVD与血、粪Cr、BUN的相关性分析 指标 血Cr 血BUN 粪Cr 粪BUN VEGF -0.035 -0.612* 0.822** 0.815** MVD -0.018 -0.511* 0.741** 0.756** *P < 0.05；**P < 0.01

表 3 肾脏VEGF和MVD与血、粪Cr、BUN的相关性分析

近年来，肾衰患者肠道清除毒素的能力成为人们研究的热点。肾衰患者尿毒素进入肠腔后可以在肠道细菌的作用下发生蛋白质氨基甲酰化反应，造成机体多核粒细胞功能障碍，加重肾衰患者的症状；肌酐、尿素等毒素也可以经肠黏膜重新吸收入血，从而加速肾小球的硬化和肾细胞的死亡^[3]。但最新研究^[4]认为，慢性肾衰患者可以通过某些机制清除尿毒素，实现机体的自我调理。由于慢性肾衰患者常伴有高血压、慢性炎症等多种基础疾病或并发症，在肾衰治疗的同时常联合其他药物进行治疗。本研究对使用较多的非甾体抗炎药物吲哚美辛和ACEI类药物贝那普利进行研究，并与盐酸川芎嗪进行比较，探讨不同药物作用下肾衰模型的肠道清除能力，有利于药物作用机制的探讨和临床治疗药物的合理选择。

本研究发现，建模成功后血、粪Cr、BUN均明显增加，说明肾衰大鼠能够通过肠道排泄来降低血肌酐和尿素氮水平。盐酸川芎嗪和盐酸贝那普利血、粪Cr、BUN与模型组相比明显降低，说明这两种药物具有延缓肾衰的作用。吲哚美辛组血、粪Cr、BUN变化较为复杂，血Cr、BUN变化并不明显而粪Cr降低、BUN升高，说明吲哚美辛对肾衰大鼠的肠道清除作用并不显著，对肾衰组织的影响可以由其他机制实现。

VEGF和MVD的关系近年来在肾衰大鼠的研究中引人注目。有人^[5]认为，机体对毒素的清除，最终依赖于肠黏膜微血管数目及血流量。Doi等^[6]对终末期肾病研究发现其小肠黏膜VEGF和MVD均明显减少，Kang^[7]尝试利用VEGF对肾衰大鼠进行替代治疗，结果发现实验大鼠内皮细胞增生，肾间质纤维化延缓，对肾功能恶化具有明显的阻断作用。多数研究^[8]也认为临床治疗后患者小肠VEGF明显增加。我们的研究对小肠黏膜VEGF和MVD的研究呈现有趣的结果。盐酸川芎嗪和盐酸贝那普利均能够明显增加VEGF和MVD。姚筱等^[9]对肾组织研究显示，ACEI类药物能够上调机体HIF-1α表达，使肾脏上皮细胞VEGF表达增加，从而进一步刺激微血管增生；我们的研究显示，该作用在小肠黏膜中同样存在。盐酸川芎嗪也呈现类似的结果。但吲哚美辛对肠黏膜VEGF和MVD的影响不同。作为目前常用的非甾体抗炎药物，吲哚美辛可以抑制COX活性，并影响肾脏血流和水盐代谢。但吲哚美辛对肾脏或肠道VEGF或MVD的影响，目前尚缺乏类似研究。我们的研究显示，吲哚美辛可以抑制肠黏膜VEGF表达，使MVD生成减少，这将导致肠道血流减少，毒素代谢缓慢。或许，这也是我们研究中粪BUN增加的原因，吲哚美辛可以进一步加重小肠黏膜微血管损伤，导致肠壁VEGF表达下调，毛细血管密度降低；同时，吲哚美辛还可以导致机体微血管收缩，肠道组织炎细胞浸润，这些均可加剧黏膜损伤^[10]，使肠道对毒素清除能力降低，体内过多的Cr、BUN无法代谢，只能通过肠道排出，造成粪Cr、BUN增高。本研究中吲哚美辛组粪Cr减低，可能是由于吲哚美辛作为非甾体抗炎药物治疗肾衰时，能够发挥消炎止痛、活血消肿的作用，能一定程度延缓肾衰的发展，从而抵消吲哚美辛加重肠道损害的作用。但由于目前国内外均缺少类似研究，本结论尚需进一步验证。

目前多数研究体现在药物对肾脏VEGF和MVD影响上。本研究从肠道对毒素清除能力的角度出发，研究不同药物对小肠黏膜VEGF和MVD的作用，但由于目前类似研究较少，希望同行能进一步研究，以进一步明确药物的综合作用机制，从而为肾衰治疗积累证据。