睾丸扭转复位是临床上典型的缺血-再灌注损伤(ischemia and reperfusion)疾病，是一种多因素参与的复杂病理过程，涉及到多个环节。其中免疫反应是造成睾丸生精功能损害作用机制之一^[1]。CD4⁺ T细胞按照细胞因子分泌模式和生物学功能分Th1细胞和Th2细胞亚群。正常机体中Th1/Th2细胞处于相对平衡的状态，但机体发生损伤时，Th1/Th2之间的平衡状态被打破，造成人体细胞因子网络的动态平衡被破坏，进而引起许多疾病的产生和发展^[2]。脂氧素A4(Lipoxin A4, LXA4) 是花生四烯酸代谢产物，在炎症反应过程中产生，具有广泛的抗炎作用。本实验研究LXA4在睾丸扭转睾丸组织中对CD4⁺ T细胞的调节和生殖功能的保护作用。

健康成年SD雄性大鼠(SPF级，购自武汉大学医学院动物实验中心)40只，随机分为假手术组、睾丸扭转组、扭转复位组、扭转复位脂氧素A4治疗组，每组各10只。睾丸扭转动物模型建立方法如前描述^[3]。A组为假手术组，SD大鼠乙醚吸入麻醉后，下腹部正中小切口，显露左侧睾丸后缝合；B组左侧睾丸扭转；C组左侧睾丸扭转后复位；D组左侧睾丸扭转2 h后复位后给予腹腔注射脂氧素A4(10 mg/kg)。各组大鼠术后饲养24 h取材。

各组大鼠左侧睾丸组织匀浆后100 μl定标后-20 ℃保存备用。ELISA法检测各组睾丸组织中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10) 的浓度(按试剂盒说明书操作)。

取新鲜睾丸组织1 g剪碎后，置入1.5 ml试管加入250 μl放射免疫分析缓冲液(RIPA buffer)和蛋白酶抑制剂混匀，冰上匀浆, 4 ℃、11 000 g离心10 min，取上清定标后备用。分别取上清根据试剂盒检测MDA、SOD、GPx活性。

取各组大鼠左侧睾丸组织4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测生殖细胞凋亡：凋亡生殖细胞核呈棕黄色染色。凋亡指数(AI)计算：随机选取每张切片100个曲细精管横切面(×400)，计数凋亡细胞，求得平均每曲细精管横切面凋亡细胞数。

取各组大鼠左侧睾丸组织，4%多聚甲醛固定后制作石蜡包埋，每只大鼠随机切片5张行HE染色，每张切片随机挑选10个视野(×200) 观察，并行Johnsen评分^[4]。新鲜睾丸组织固定2.5%戊二醛PBS缓冲液4 ℃固定2 h, 洗涤后用1%锇酸PBS液固定2 h，洗涤后脱水并浸入Epon812中，用LKB-V切片机(BROMMA，瑞典)切片，收集切片用醋酸铀和叶酸铅染色，用透射电子显微镜(H-600，日本日立公司)照像。

所有计量资料用均数±标准差(x±s)表示，SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)和组间比较，P＜0.05为差异有显著性。

与假手术组相比，睾丸扭转后Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2) 和MDA显著升高(P＜0.05)，而SOD、GPx明显降低，LXA4治疗组数据比较无差异。与B组和C组比较，LXA4治疗组Th2型细胞因子(IL-4、IL-10), 以及睾丸组织SOD、GPx显著升高(P＜0.05)，细胞因子IFN-γ、IL-2和睾丸组织MDA水平降低明显(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 各组睾丸组织炎性因子ELISA数值以及MDA、SOD、GPx的变化(x±s) 组别 IFN-γ(μg/g) IL-2(μg/g) IL-4(μg/g) IL-10(μg/g) MDA(μmol/mg) SOD(IU/mg) GPx(IU/mg) A 1.21±0.43 1.17±1.30 10.54±0.37 0.73±0.25 2.10±0.35 82.17±0.47 4.93±0.43 B 2.17±0.51# 1.81±1.27# 0.75±0.21 0.84±0.31 5.21±0.47# 41.07±0.42* 2.45±0.32* C 2.63±0.47# 1.74±1.18# 0.89±0.13 1.04±0.53 5.87±0.34# 42.13±0.37* 2.31±0.37* D 1.57±0.39 1.31±1.07 1.72±0.24▲ 1.81±0.45▲ 2.83±0.57 60.75±0.41▲ 4.74±0.31▲  与假手术组比较，#P＜0.05，*P＜0.05;与B组和C组比较, ▲P＜0.05

表 1 各组睾丸组织炎性因子ELISA数值以及MDA、SOD、GPx的变化(x±s)

光镜下与睾丸扭转组和扭转/复位组比较，LXA4治疗组睾丸凋亡指数明显降低(P＜0.05)，睾丸生精上皮及曲细精管形态完整，Johnsen评分明显升高(P＜0.05，表 2)。透射电镜下，B组和C组生殖细胞内线粒体内嵴结构破坏，溶酶体肿胀，细胞间隙增宽，LXA4治疗组细胞结构完整(图 1)。

表 2(Table 2)

表 2 各组睾丸组织凋亡指数AI和Johnsen评分变化(x±s) 组别 凋亡指数AI(%) Johnsen评分 A 8.41±3.10 7.50±0.80 B 32.40±7.10 5.22±1.21 C 30.52±10.20 5.50±1.00 D 14.30±6.75* 7.15±1.50*  与B组和C组比较, *P＜0.05

表 2 各组睾丸组织凋亡指数AI和Johnsen评分变化(x±s)

图 1(Figure 1)

图 1 各组左侧睾丸组织透射电镜下形态改变(×2 000) A:假手术组，正常睾丸；B:睾丸扭转组，线粒体和溶酶体肿胀，细胞间隙增宽；C:睾丸扭转/复位组，线粒体嵴结构破坏，溶酶体肿胀，细胞间隙增宽；D: LXA4治疗组，线粒体嵴结构完整，溶酶体无肿胀，细胞间连接紧密

睾丸扭转病理性损伤是造成睾丸组织生殖功能损害原因之一，研究表明一侧睾丸扭转，对侧睾丸生精功能同样会受到损害，其中CD4⁺ T细胞介导的免疫反应损害是重要因素之一^{[5, 6]}。患侧睾丸生精上皮及间质在缺血-再灌注过程中均受到不同程度的损害，全身或睾丸局部在抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APC)辅助作用下使CD4⁺ T淋巴细胞抗原产生免疫应答反应。CD4细胞受到抗原刺激后开始活化、增殖分化为效应细胞^[7]。CD4⁺ T细胞按照细胞因子分泌模式和生物学效应不同分Th1细胞和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌的IFN-γ和IL-2, 主要参与细胞介导的免疫反应；Th2细胞主要分泌的IL-4和IL-10, 主要参与体液介导的免疫反应。Th1细胞分泌的IFN-γ对Th2细胞有抑制作用，同时Th2细胞分泌的IL-4对Th1细胞有抑制作用^[8]。

脂氧素有强力的抗炎症作用，在炎性反应中拮抗自然杀伤细胞、白三烯发挥广泛的抗炎、促进炎症消散和抗增殖作用。LXA4是脂氧素家族亚型之一，其作用主要是机体炎症反应时发挥抗炎、抗凋亡、抗增殖等作用, 但不参与机体各种正常生理功能的维持^[9]。LXA4作为炎性反应的“刹车信号”和抗炎分子已有论述^{[10, 11]}。

本实验研究表明，与对照组比较，睾丸缺血-再灌注经LXA4治疗后可以降低扭转睾丸组织中炎性因子IFN-γ和IL-2生成水平，及抑制Th1细胞活性；同时升高了IL-4、IL-10水平，及促进Th2细胞作用。同时降低了睾丸组织中MDA含量，提高了组织中SOD、GPx活性，改善了睾丸组织氧供。睾丸组织形态结构观察可见，经LXA4治疗后缺血-再灌注睾丸组织结构保持完整，生殖细胞内细胞核、溶酶体和线粒体等结构及功能未见明显破坏。可能的机制是LXA4抑制Th1细胞活性，促进Th2细胞作用，降低血管内皮细胞活性氧产生，保持完整的血睾屏障，减少中性粒细胞的渗出, 减少中性粒细胞的活化和浸润, 减少再灌注过程中氧自由基生成对生殖细胞损伤, 从而保护再灌注生殖细胞。

因此，LXA4在睾丸缺血-再灌注过程中可以通过调节CD4⁺ T细胞炎性因子的释放，降低再灌注损伤炎症对生殖细胞的损伤，对生殖功能起保护作用。