国家卫生部发布的中国出生缺陷防治报告指出，我国是出生缺陷高发国家, 发生率为5.6%，每年新增出生缺陷数约90万例。而产前诊断是当前预防出生缺陷、减少缺陷胎儿出生的有效措施之一。自发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA后，无创产前检测技术 (noninvasive prenatal testing, NIPT) 由于其克服了传统产前诊断对胎儿或孕妇造成危害、流产的风险从而得到了越来越广泛的应用^[1]。其中孕妇血浆中胎儿游离DNA浓度 (cfDNA-F) 是NIPT临床运用中的重要指标。低cfDNA-F会导致NIPT检测失败以及假阴性结果的产生^[2]，高cfDNA-F可能与先兆子痫及早产相关^[3]。因此，需对cfDNA-F进行准确检测以提高NIPT的临床实用性。

目前检测胎儿DNA浓度的方法包括：①基于Y染色体基因 (ChrY) 标记男胎DNA，应用实时定量PCR或高通量测序检测cfDNA-F，但不能检测女胎浓度^[4]。②基于表观遗传学方法检测，Elisavet等发现胎儿DNA和孕妇血浆DNA上的部分基因存在甲基化程度的不同，结合荧光实时定量PCR可检测cfDNA-F，但准确度有限且和基因甲基化程度有关^{[5, 6]}。③基于胎儿特异性杂合位点，对比父亲基因型信息和母亲基因型信息，以此确定胎儿中来源于父亲的特异性位点，采用PCR或芯片捕获结合高通量测序计算cfDNA-F，无论胎儿性别为何均可采用本方法计算^{[7, 8]}。但芯片设计周期较长，成本高，临床使用有一定局限性。为更好地克服上述不足，本研究采用多重PCR结合高通量测序技术 (MTPCR+测序) 检测胎儿特异性SNP位点，以作为胎儿DNA标记物来计算cfDNA-F。

本研究收集了2014年5月-2015年5月深圳华大基因临床检验中心进行NIPT检测的孕妇血浆样本，样本需满足：①孕妇年满18周岁。②孕周不小于12周。③单胎妊娠。从中筛查出21三体综合征 (T21) 阳性样本5例，年龄29-38(33.0±2.7) 岁。同时收集了正常孕妇血浆样本32例，其中男胎30例，女胎2例，年龄20-34(27.0±3.5) 岁。经深圳华大基因伦理委员会批准，并与孕妇签署知情同意书后，抽取5 ml外周血。另选取1例未怀孕女性DNA作为阴性对照、1例正常男性DNA作为阳性对照，检测结果均由核型验证或胎儿产后体检验证。

收集的外周血加EDTA抗凝，8 h内进行血浆分离，2 000 r/min离心10 min，吸取上层血浆于无菌管中，再次14 000 r/min离心10 min，吸取上层血浆并分装，-80 ℃保存。

取待检血浆600 μl，应用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit并按操作说明进行游离DNA提取。60 μl AE Buffer洗脱。

在人类基因组中筛选出变异系数 (impact factor) 大于0.3的255个高频SNP位点，并针对每个SNP位点设计优化出一对引物，其产物长度为100-130 bp, 由Ion Ampliseq设计合成多重PCR引物。采用Ion Ampliseq多重PCR方法并按操作说明进行。反应体系20 μl：DNA+去离子水共6 μl，5×HiFi Mix 4 μl，2×primer pool 10 μl。多重PCR反应条件：99 ℃，2 min后，99 ℃，15 s；60 ℃，4 min；共22循环。

取全部多重PCR产物20 μl先后进行0.6×、1.2×AMPure XP磁珠纯化。采用Ion AmpliSeq Library Kits 2.0并按操作说明进行文库构建，依次进行末端修复、接头连接、PCR。所得文库采用1.5×AMPure XP磁珠纯化后，应用Agilent 2100进行质检，合格后采用Ion Proton高通量测序平台测序。

通过两条拟合曲线划定目标区域, 如图 1。计算每一个蓝色区域SNP位点即AAab所代表的cfDNA-F，取中位数作为该样本的最终结果。第一步，将ABaa和ABab位点去掉。由于cfDNA-F不会超过50%，确定ABaa的次高碱基的期望值在x/2到x/3之间，另外ABab的次高碱基的期望值在x/2，采用y=x/3拟合线去掉ABaa和ABab这两类的SNP。第二步，去掉AAaa得到AAab的SNP。当母亲和胎儿都是纯和时该位点没有SNP，但由于测序组装错误的存在产生了AAaa类型的SNP。根据Jiang和Roth等研究中测序错误产生的SNP位点服从二项分布，根据中心极限定理可视作正态分布^{[9, 10]}。当n大于20且P小于5%时，二项分布可以近似视作泊松分布。因此可将比对过程 (其SNP位点的P≤1%) 可以认为该正态分布的方差等于期望。在测序错误为1%时，期望为每个位点的测序深度乘以1%，即期望和方差都是 (x+y)×0.01。在正态分布中可采用y=(x+y)×0.001+3×[(x+y)×0.001]^0.5将AAab与AAaa区分开来。第三步，通过目标区域内的SNP位点计算胎儿浓度。方程：f₁=2x_i/(x_i+y_i)。

图 1(Figure 1)

图 1 含有母亲纯合胎儿杂合SNP位点 (AAab) 目标区域的划定 55个SNP共分为四类：AAaa (母亲纯合胎儿纯合SNP)、AAab、ABaa (母亲杂合胎儿纯合SNP)、ABab (母亲杂合胎儿杂合SNP)。大写字母 (A/B) 代表来自母亲，小写字母 (a/b) 代表来自胎儿，A/a代表pileup文件 (http://samtools.sourceforge.net/pileup.shtml) 中的最高碱基，B/b代表pileup文件中的次高碱基。x轴代表最高碱基，y轴代表次高碱基

对于35例孕有男胎的孕妇血浆 (30例正常样本，5例T21样本) 的胎儿游离DNA浓度结果，采测序结果所计算cfDNA-F进行验证；对于2例孕有女胎的孕妇血浆cfDNA-F，采用芯片捕获测序计算进行验证。并对MTPCR+测序和相应验证方法计算结果进行相关性分析。对实验组正常男胎cfDNA-F和对照组T21男胎cfDNA-F进行比较，采用t检验分析。

分别对32例血浆样本进行cfDNA-F，其中孕有男胎孕妇血浆30例，孕有女胎孕妇血浆2例。MTPCR+测序结果 (11.2%±5.5%) 与ChrY测序及芯片捕获测序计算cfDNA-F (10.9%±5.3%) 进行对比，所有检测样本的浓度差异均在1.9%以内，不同方法检测结果无差异 (P＞0.05)。并对5例孕有T21男胎孕妇血浆样本分别采用上述两种方法进行对比，所测样本浓度差异在1.9%以内，两种方法无显著差异 (P＞0.05)。在所有样本分析中，两种方法具有显著相关性 (R²=0.98)，见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 胎儿游离DNA浓度的验证

分别对相同孕周的孕有正常男胎组和孕有T21男胎组采用MTPCR+测序计算胎儿浓度，并对比分析见表 1。采用F检验，两组方差不存在显著差异 (P＞0.05)，即方差相等；再进行T检验，两组浓度均值存在显著差异 (P＜0.05)，孕有T21男胎组的cfDNA-F约为孕有正常胎儿组的1.5倍。

表 1(Table 1)

表 1 相同孕周的正常男胎实验组和T21男胎对照组的胎儿游离DNA浓度对比 组别 样本数 胎儿DNA 浓度范围 (%) 胎儿DNA 浓度均值 (%) 正常男胎孕妇血浆 10 7.7-16.7 11.8±3.4 T21男胎孕妇血浆 5 12.7-24.3 17.3±4.7  两组浓度均值相比较，P＜0.05

表 1 相同孕周的正常男胎实验组和T21男胎对照组的胎儿游离DNA浓度对比

本研究方法针对高频突变SNP位点设计了255对引物，所采用的Ampliseq多重PCR技术可同时扩增最多2 000对引物，结合高通量测序技术，对富集的PCR产物实行高深度测序 (1 000×) 精确检测，筛选出其中AAab位点。由于PCR产物长度短 (100-130 bp), 单样本数据量只需1 M reads即可确定单碱基情况，而Ion Proton SE200平台测序单次数据量为90 M reads以上，故一次可对90例以上样本进行cfDNA-F检测，通量高出以前方法数倍从而有效降低测序成本。由于采用多个胎儿特异性SNP而非ChrY上数目有限的基因作为胎儿DNA标记物，因此本研究方法既能检测男胎cfDNA-F, 也能检测女胎cfDNA-F，并且采用多个SNP位点计算cfDNA-F也比只采用ChrY上的少数位点计算更为准确。此外，本方法还能整合到同样采用高通量测序技术原理的NIPT中。

应用实时定量PCR或高通量测序检测ChrY染色体上特异性基因是检测孕妇血浆中男胎cfDNA-F的重要方法^{[1, 4, 11]}, 具有准确、实用性高的特点。对于女胎cfDNA-F，可采用目标区域捕获女胎特异性位点进行测序，从而准确计算^{[12, 13]}。本研究将多重PCR结合高通量测序计算的cfDNA-F与上述方法进行比较，两者没有显著差异，且具有较高的一致性。因此，本研究方法能较准确地计算cfDNA-F，初步具备了实际应用价值。由于目标区域捕获结合测序的周期长、成本高，被验证的女胎样本较少，在女胎中检测的准确性仍需要进一步研究。

本研究也验证了cfDNA-F在孕有T21胎儿组和孕有正常胎儿组中的差异，与Zhou等研究相一致^[11]。表 1中两组浓度范围虽有重叠，可能由于T21样本量少的原因，但总体上趋势已证明胎儿游离DNA浓度在孕有T21三体孕妇的血浆中是明显增高的，胎儿游离DNA浓度对产前唐氏综合征筛查具备一定辅助性意义。

综上所述，孕妇血浆中cfDNA-F作为无创产前诊断的关键质控指标对NIPT的临床实用和辅助均具有显著意义。当前无创产前诊断难以测到低浓度样本中的胎儿游离DNA序列，从而导致检测失败和假阴性率上升。因此，开发准确的胎儿游离DNA浓度检测方法可在临床指导中发挥重要作用。