对于肿瘤的治疗，除手术外，临床上的传统方案主要是化疗或放疗，然而此种方案的副作用大，增加患者的死亡风险。近年来，免疫疗法作为一种全新的治疗手段逐渐被应用于临床。其中，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, CART)以其独特的抗肿瘤优势^[1]，已成为全球生物医学领域研究的热点。CART技术是指将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Single chain antibody fragment, Scfv)与胞内信号区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)^[2]。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CART细胞，然后静脉回输入患者体内，能够特异性的识别并靶向肿瘤细胞^[3]。CART与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。

目前，CART免疫疗法在血液系统肿瘤中的治疗效果尤为突出^{[4, 5]}，其中以CD19-CART的临床应用最为广泛，已成为国内外大多数临床研究机构针对B淋巴细胞血液肿瘤的模式疗法^{[6, 7]}。此外，CD22-CART作为CD19肿瘤靶点丢失时的补救疗法，逐渐开展临床研究^{[8, 9]}。因此，有研究者提出序贯回输CD19和CD22多靶点CART细胞，将成为治疗难治复发性B淋巴细胞白血病的有效措施。大量临床报道显示，CART细胞在体内持续增殖是保证治疗效果的关键因素^[10]，如何快速、准确检测出CART细胞的增殖情况至关重要。对于单靶点CART疗法，国内外主要通过流式细胞仪技术进行检测，然而，对于双靶点甚至多靶点CART疗法，流式技术无法准确区分而受到限制。本研究采用TaqMan实时荧光定量技术，通过设计特异探针能够准确检测不同靶点的慢病毒拷贝数，进而确定CART在体内的增殖情况，为制定下一步临床治疗方案提供可靠依据。

本研究所用细胞株293T保存于武汉科技大学生物医学研究院中心实验室；Raji细胞由华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科惠赠；pTK881慢病毒质粒系统由美国北卡大学惠赠；本研究中的CART细胞治疗患者均来自华中科技大学同济医学院附属同济医院，T细胞从其血液中分离得到。该研究已获得华中科技大学附属同济医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。

DMEM培养基、T细胞培养基OpTmizer^TM CTS^TM T-Cell Expansion SFM和胎牛血清购自Gibco公司；病毒浓缩液Lentivirus Concentration Solution(6×)购自GeneCopoeia公司；Lipfectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司；IL-6细胞因子ELISA检测试剂盒购自Biolegend公司；血液全基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒Probe qPCR Mix购自大连宝生物工程有限公司。全波长分光光度计为Molecular Devices公司产品，实时定量PCR仪CFX 96为Bio-Rad公司产品。

细胞培养：293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；T细胞和Raji细胞用含10⁵ U/L的人重组IL-2的OpTmizer^TM CTS^TM T-Cell Expansion SFM培养基培养。

重组质粒转染293T细胞：将293T细胞铺于10 cm皿中，待细胞长到对数生长期时，将构建好的pTK881-CD19scfv/pTK881-CD22scfv质粒12 μg与包膜蛋白VSVG 4 μg、结构蛋白NRF 8 μg混匀，加入24 μl的Lipfectamine 3000转染试剂，室温孵育25 min，缓慢的滴加入293T细胞，在37 ℃含5% CO₂的培养箱中培养6-7 h换成完全培养基，继续培养72 h后从上清中收取病毒。

病毒感染293T或原代T细胞：将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，分成转染组和阴性对照组，按照感染复数(multiple of infection, MOI)=10进行感染，48 h后，收集细胞进行后续检测。

将转染慢病毒质粒的293T细胞上清经0.45 μm微孔滤膜过滤收集病毒，将慢病毒与浓缩试剂按照5:1的比例混合，4 ℃孵育过夜。完成孵育后，将混合液在4 ℃温度下3 500 g离心25 min，小心弃去上清液。根据收集的慢病毒上清液体积，量取其1/100体积的PBS，轻轻吹打悬起慢病毒沉淀。将浓缩的病毒分装后保存在-80 ℃，并同时取少量测定病毒滴度确保病毒包装成功。

以前期研究中确定有效的CD19和CD22的scfv序列为靶标，用ABI Primer Express 2.0软件设计TaqMan探针和引物(见表 1)，然后将设计好的序列在NCBI上进行Blast比对，以确保探针和引物的特异性。探针5′端荧光标记为FAM，3′端荧光标记为MGB，探针和引物送于武汉擎科生物技术有限公司合成。

表 1(Table 1)

表 1 antiCD19-CART和antiCD22-CART的检测探针及引物序列 探针或引物名称 序列信息(5′-3′) 探针标记 扩增片段大小 antiCD19-probe CCTACACCTTTGGCGGCGGAAC 5′-FAM, 3′-MGB antiCD19-CART-F CCAGCAGGGCAACACACTG 113 bp antiCD19-CART-R GCTTTCCTGCAGCTTCACCT antiCD22-probe TCTCTCAAACTGTCTTGTGCCGCT 5′-FAM, 3′-MGB antiCD22-CART-F CTGGTGAAACCTGGGGG 162 bp antiCD22-CART-R CTTCACGGTATCGGGGTA

表 1 antiCD19-CART和antiCD22-CART的检测探针及引物序列

将转染CD19和CD22慢病毒的CART细胞与Raji细胞分别按照1:1、10:1和20:1的比例混合，培养于48孔板中，单独培养CART细胞和Raji细胞设为阴性对照组，每孔中加入终浓度为5 μmol/L的活细胞荧光染料CMTMR，每组均设定3个复孔。细胞培养24 h后，通过流式检测活细胞数，计算杀瘤效率。此外，取细胞培养上清，根据ELISA试剂盒操作说明，检测每组的细胞因子IL-6的表达水平，通过制作标准曲线，计算IL-6的释放量。

将构建好的包含CD19或CD22 scfv片段的重组质粒，在大肠杆菌DH5α中扩大培养，提取质粒，用作建立荧光定量方法的标准品。将标准品浓度调整为1.0×10⁸ copies/ml，按每管20 μl分装后冻存于-80 ℃备用。本研究所用的模板为10倍系列稀释的标准品，浓度从1.0×10⁷ copies/ml至1.0×10² copies/ml。TaqMan荧光定量PCR的反应体系为20 μl，内含Probe qPCR Mix 10 μl，TaqMan Probe (10 μmol/L)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板1 μl，PCR级水5 μl。循环条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s和60 ℃ 30 s共40个循环。检测回输CART细胞后的临床血液样本中病毒拷贝数时，使用回输前的样本作为阴性对照组，浓度为1.0×10⁸ copies/ml的标准品作为阳性对照组。

本研究中的所有实验均至少做3个重复。以SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理；数据资料以x±s表示，组间比较均采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

本研究选用的第三代CAR包含共刺激分子CD28、41BB和CD3z链(图 1A)，能更大程度的激活T细胞^[11]。B淋巴细胞白血病相关抗原的抗体scfv区(CD19和CD22)由引导序列(Leader)、抗体轻链(Light chain)、连接序列(Linker)和抗体重链(Heavy chain)组成(图 1C和D)，能够特异性的靶向肿瘤细胞。本研究将完整的CAR结构连接至慢病毒载体pTK881上，酶切位点为Xba Ⅰ和Xho Ⅰ，重组载体的双酶切鉴定见图 1B，CD19和CD22的目标序列大小分别为1 554 bp和1 611 bp。此外，为了更直观地检测载体的转染效率，本实验同时将目标片段连接至含EGFP蛋白的pTK642载体上，从图 2可以看出，载体转染效率约80%。重组载体经测序验证正确后，-80 ℃保存备用。

图 1(Figure 1)

图 1 CD19和CD22抗体单链可变区慢病毒载体构建 A：载体构建示意图；B：重组载体酶切验证；C和D分别是CD19和CD22抗体scfv序列结构

图 2(Figure 2)

图 2 慢病毒包装检测(×100) A：自然光下的293T细胞；B：蓝光激发下的293T细胞

为保证临床治疗效果，本研究在回输前对CART细胞的杀瘤效率进行体外验证。结果如图 3所示，CART细胞与Raji细胞20:1共培养组的杀瘤效率极显著高于1:1培养组(图 3A, 3C，P＜0.01)，10:1共培养组的杀瘤效率显著高于1:1培养组(图 3A, 3C，P＜0.05)。CART细胞与Raji细胞共培养组(1:1, 10:1, 20:1)的IL-6水平显著或极显著高于CART细胞或Raji细胞单独培养组(图 3B, 3D, P＜0.05或P＜0.01)。由此可见，携带CAR的重编程T细胞在体外具有杀伤瘤细胞、刺激其释放细胞因子的作用。

图 3(Figure 3)

图 3 体外检测CART细胞的杀瘤效率 A：CD19-CART细胞的杀瘤效率；B：CD19-CART组IL-6的释放水平；C：CD22-CART细胞的杀瘤效率；D：CD22-CART组IL-6的释放水平, *P＜0.05, **P＜0.01

标准曲线的灵敏度检测是TaqMan实时定量PCR技术的关键环节。本研究对系列稀释的标准品(1.0×10¹-1.0×10⁸ copies/ml)进行测试，结果如图 4所示，CD19和CD22的检测下限均为1.0×10²，检测上限设定为1.0×10⁷(可以满足临床样本不同回输时期的检测需求)。相邻浓度梯度之间的Ct值相差3左右，标准曲线斜率在-3.3--3.4之间。

图 4(Figure 4)

图 4 定量PCR标准曲线的灵敏度检测 A：标准品对应的Ct值；B：CD19和CD22的标准曲线

为了体外评估TaqMan检测技术，本研究对293T细胞进行不同的转染处理，分为空白对照组、空病毒对照组、空质粒对照组、CD19/CD22慢病毒组和CD19/CD22质粒组，然后检测CD19-CAR和CD22-CAR的病毒拷贝数。结果如图 5所示，转染病毒和质粒组的慢病毒拷贝数均显著高于对照组(P＜0.05)，其中感染病毒组的拷贝数稍高于质粒组，说明CD19和CD22 CAR均成功嵌合，且TaqMan实时定量技术能够精确地检测慢病毒拷贝数。

图 5(Figure 5)

图 5 293T细胞中慢病毒拷贝数检测 A：CD19的质粒和慢病毒转染293T细胞的拷贝数检测；B：CD22的质粒和慢病毒转染293T细胞的拷贝数检测

本研究入组4名急性B淋巴细胞白血病患者，所有患者接受CD19-CART和CD22-CART序贯治疗。以回输体外培养的CART细胞当天为第0天计算，回输20 min后采集2 ml血液，随后在回输后的第10，15，30，35天分别采集血液样本，提取血浆基因组DNA，检测慢病毒拷贝数，以此反映CART细胞在病人体内的增殖情况，通过持续检测该指标分析CART在体内的存续时间。检测结果如图 6所示，4名患者分别在第0天回输CD19-CART和CD22-CART细胞20 min后，体内病毒拷贝数迅速上升至10²-10⁴，且均在第10天急剧上升至10⁴-10⁷，与第0天相比呈现显著升高(P＜0.05)。Donor1和Donor2两名患者的CD19-CART在第15，30，35天变化平稳，Donor3和Donor4在第30，35天有所下降，但均显著高于初始回输水平(P＜0.05)。Donor1、Donor2和Donor4的CD22-CART病毒拷贝数在第30天达到最高，Donor3在第30，35天有所下降，但均高于初始回输水平。由此可见，通过检测病毒拷贝数有助于临床医生准确掌握携带不同靶点的CART细胞在体内的变化，为制定进一步治疗方案提供科学依据。

图 6(Figure 6)

图 6 患者回输CART细胞后体内病毒拷贝数监测

早期的CART细胞是通过质粒电转获得的，由于转染效率低，体外培养周期长，回输入患者体内后迅速衰减，临床效果极差^[10]。随后研究者们利用慢病毒质粒挂载CAR结构，实现T细胞修饰，体外培养周期缩短，CART细胞表现更“年轻”，具有较强的持续扩增潜能^[13]。

经修饰的CART细胞回输入患者体内后，与靶细胞相互作用会刺激释放细胞因子(如IL-6)，一定水平的细胞因子释放可以反映CART免疫细胞的治疗效果^[14]。然而，过度的细胞因子释放会造成严重的不良反应。本研究通过在体外检测CART细胞与Raji瘤细胞共培养时的杀瘤效率和细胞因子IL-6水平，综合反映CART细胞的杀瘤功效。

CART研究初期，科学家们认为CART细胞的输注量与治疗效果直接相关。然而，June等人报道了一例在输注较低量的CART-CD19后，CART细胞在体内扩增了1 000倍，白血病得到很好的控制^[15]。由此说明，CART细胞在体内是否有效扩增对于癌细胞的杀伤至关重要，因此，对CART扩增水平的跟踪监测就显得尤为重要。对于单靶点CART疗法，研究者们主要通过流式细胞仪技术，采用通用抗体检测CART在体内的变化^[16]。然而，对于多靶点的CART序贯疗法，由于缺乏特异性抗体，流式细胞检测技术受到限制，无法在病人体内区分多种CART细胞。因此，本研究采用TaqMan技术，通过设计特异探针，靶向每种CAR结构中的scfv片段，跟踪监测回输CART后不同时间段慢病毒拷贝数变化。该技术具有快速、准确、成本低等显著优势，能够在CART序贯疗法中准确判断特定CART细胞的增殖情况，为下一步临床干预提供重要依据。

总之，抗肿瘤是一场漫长而艰难的“微观战斗”。CART免疫疗法的临床效果评估需长期的随访和复查。本研究监测了回输CART后患者体内的病毒拷贝数，结果显示，回输后第35天时患者病情仍处于缓解状态。这些结果表明，动态观察CART细胞在体内的变化情况，有助于临床治疗的判断和干预。然而，采用慢病毒挂载CAR结构的安全问题还有待探讨，一些新的技术思路逐渐发展起来并有望应用于临床，如通过电转mRNA制备短期效应的CART、引入自杀基因提高CART在体内的可控性、诱导激活CART等。随着技术的不断优化和改进，CART在实体肿瘤治疗中的也将“崭露头角”，成为肿瘤治疗事业的一个里程碑。