武汉大学学报(医学版)   2018, Vol. 39Issue (2): 269-272   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.0892.
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引用本文 

李崇佼, 何勇, 兰晓莉, 张永学, 冯洪燕, 夏晓天, 田月丽, 汪长银, 文兵. 凋亡显像剂99mTc(CO)3-Annexin V的制备及其在小鼠体内的生物学分布[J]. 武汉大学学报(医学版), 2018, 39(2): 269-272. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.0892.
LI Chongjiao, HE Yong, LAN Xiaoli, ZHANG Yongxue, FENG Hongyan, XIA Xiaotian, TIAN Yueli, WANG Changyin, WEN Bing. Preparation of Apoptosis Imaging Agent 99mTc(CO)3-Annexin V and Its Biodistribution in Mice[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2018, 39(2): 269-272. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.0892.

作者简介

李崇佼，女，1985-，医学博士，主治医师，主要从事核医学及分子影像学研究，E-mail：LCJ0301@163.com

基金项目

国家自然科学基金资助项目(编号：81501512);湖北省卫生厅一般项目(编号：JX6B17);中央高校基本科研业务费专项资金项目(编号：2042015kf0078);武汉大学中南医院青年基金项目(编号：2014A10)

通讯作者

文兵，男，1963-，副主任医师，主要从事核医学及分子影像学研究，E-mail：wbwd6666@sina.com

文章历史

收稿日期：2017-09-20
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
凋亡显像剂99mTc(CO)3-Annexin V的制备及其在小鼠体内的生物学分布
李崇佼 1, 何勇 1, 兰晓莉 2, 张永学 2, 冯洪燕 2, 夏晓天 2, 田月丽 1, 汪长银 1, 文兵 1     
1. 武汉大学中南医院核医学科 湖北 武汉 430071;
2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科/湖北省分子影像重点实验室 湖北 武汉 430022
收稿日期：2017-09-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81501512);湖北省卫生厅一般项目(编号：JX6B17);中央高校基本科研业务费专项资金项目(编号：2042015kf0078);武汉大学中南医院青年基金项目(编号：2014A10)
作者简介：李崇佼，女，1985-，医学博士，主治医师，主要从事核医学及分子影像学研究，E-mail：LCJ0301@163.com
通讯作者：文兵，男，1963-，副主任医师，主要从事核医学及分子影像学研究，E-mail：wbwd6666@sina.com
[摘要] 目的: 使用放射性核素99mTc标记特异性靶向凋亡蛋白Annexin V，并研究标记化合物在小鼠体内的药代动力学特点。方法: 采用Tricarbonyl kit制备标记前体三羰基锝化合物盐溶液以标记Annexin V；测定标记化合物的标记率、放化纯及稳定性。通过生物分布实验研究99mTc(CO)3-Annexin V在健康昆明小鼠体内的药代动力学特点。结果: 成功制备了99mTc(CO)3-Annexin V，标记率为(57.21±2.83)%，比活度为(5.65±0.43) mCi/100 μg，放化纯>90%，其在体外稳定性良好，至标记后6 h放化纯仍大于>90%。99mTc(CO)3-Annexin V在小鼠体内循环半衰期较短，注入体内2 h后即可排出约40%，4 h后排出约60%。肾脏和肝脏是99mTc(CO)3-Annexin V的主要排泄器官。结论: 本研究表明利用Tricarbonyl kit可以成功将放射性核素99mTc标记Annexin V，标记率高且方法简便可行，是一种具有广泛应用前景的凋亡显像剂。
关键词：Annexin V    三羰基锝    凋亡显像    昆明小鼠    生物分布    
Preparation of Apoptosis Imaging Agent 99mTc(CO)3-Annexin V and Its Biodistribution in Mice
LI Chongjiao1, HE Yong1, LAN Xiaoli2, ZHANG Yongxue2, FENG Hongyan2, XIA Xiaotian2, TIAN Yueli1, WANG Changyin1, WEN Bing1     
1. Dept. of Nuclear Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China;
2. Dept. of Nuclear Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology & Hubei Key Laboratory of Molecular Imaging, Wuhan 430022, China
[Abstract] Objective: To label the protein Annexin V for targeting apoptosis with radionuclide 99mTc, and to study pharmacokinetics of 99mTc(CO)3-Annexin V in mice. Methods: The Tricarbonyl kit was used to prepare labelled precursor, and the Annexin V was labeled with carbonyl technetium. Then, the labeling yield, radiochemical purity and stability of 99mTc(CO)3-Annexin V were determined. The metabolic characteristics of 99mTc(CO)3-Annexin V were assessed in healthy Kunming mice by the biodistribution studies. Results: The 99mTc(CO)3-Annexin V was prepared successfully, with labeling yield of (57.21±2.83)%, specific activity of (5.65±0.43) mCi/100 μg, and radiochemical purity more than 90%. 99mTc(CO)3-Annexin V had excellent stability and the radiochemical purity was also more than 90% at 6 h in vitro. Biodistribution studies showed that the half-life of 99mTc(CO)3-Annexin V was short in mice, manifested by about 40 and 60 percent of 99mTc(CO)3-Annexin V that could be removed at 2 h and 4 h after injection, respectively. In addition, the kidney and liver were the main excretory organs of 99mTc(CO)3-Annexin V in vivo. Conclusion: 99mTc(CO)3-Annexin V can be prepared successfully using Tricarbonyl kit with high labeling yield and simple method. It is a kind of apoptosis imaging agent with wide application prospect.
Key words: Annexin V    Three Carbonyl Technetium    Apoptosis Imaging    Kunming Mice    Biodistribution    

凋亡即细胞的程序性死亡，是高度调节的、钙能依赖性过程，且无炎症导致的核质碎裂和胞膜起泡，最终凝聚被邻近细胞吞噬。对于中枢神经系统疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、器官及骨髓移植排斥反应、肿瘤等诸多疾病，早期检测细胞凋亡具有重要意义。与核磁共振脂类波谱学、弥散加权成像、光学成像、高频超声等活体凋亡显像手段相比，放射性核素凋亡显像可在细胞凋亡发生早期即先于形态学改变之前就能够检测到凋亡的发生，是目前研究最多也是最具临床应用前景的活体凋亡显像方法。

细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)在正常情况下只位于细胞膜内侧，细胞发生凋亡时，PS由膜内移向膜外暴露于细胞表面，这一特性为早期活体监测细胞凋亡提供了理论依据。膜联蛋白V(Annexin V)是一种由319个氨基酸组成、分子质量为35.8 kU的内源性小分子蛋白。Annexin V能够与暴露于凋亡细胞膜表面的PS发生特异性高亲和力结合而不进入细胞内，是一种能够检测细胞凋亡的特异、敏感且可靠的反应蛋白[1]。本研究使用三羰基锝制备标记化合物99mTc(CO)3-Annexin V，并研究其在动物体内的药代动力学特点，以期提供一种可早期、实时、无创检测活体内细胞凋亡的特异性显像剂。

1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器

凋亡靶向蛋白Annexin V购自北京华大蛋白质研发中心有限公司。99Mo-99mTc发生器由北京原子高科股份有限公司提供。丙酮、甲醇及瞬时薄层色谱层析硅胶板(instant thin-layer chromatography-silica gel，ITLC-SG)等实验用试剂及耗材均为华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科及湖北省分子影像重点实验室友情提供。健康昆明小鼠(雄性，20-25 g)购自武汉大学动物实验中心。

1.2 实验方法 1.2.1 三羰基锝的制备

将1 ml由99Mo-99mTc发生器淋洗的新鲜高锝酸钠盐溶液([99mTcO4]-，10-20 mCi)注入10 ml密封的Tricarbonyl小瓶中，混匀后将密封小瓶放入沸水浴中20 min，取出小瓶待其冷却至室温后备用。

每个Tricarbonyl小瓶冻干粉内容物包括：硼碳酸钠(sodium-boranocarbonate，4.5 mg)、十水四硼酸钠(sodium tetraborate·10H2O，2.9 mg)、四水酒石酸钾钠(potassium sodium tartrate·4H2O，9.0 mg)和碳酸钠(sodium carbonate，7.8 mg)。

1.2.2 99mTc(CO)3-Annexin V的制备

使用新鲜配制的1 mol/L HCl溶液将碱性的三羰基锝前体溶液调整为中性，pH: 6.5-7.0。将400-500 μl中性前体溶液移入1.5 ml EP管中，加入100 μg蛋白Annexin V(2 mg/ml)，混匀后放入37 ℃水浴锅中孵育60 min。标记产物经PD-10柱纯化后备用。以体积比为1:1的丙酮/甲醇混合液作为展开剂、以ITLC-SG为固定相展开，测量标记产物的放射化学纯度。

1.2.3 99mTc(CO)3-Annexin V的稳定性研究

将99mTc(CO)3-Annexin V分别与等体积胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)混匀后37 ℃孵育，至6 h时分别测量标记化合物的放化纯，从而检测其体外稳定性。

1.2.4 生物分布研究

将99mTc(CO)3-Annexin V(80-100 μCi)经尾静脉注入昆明小鼠体内(n=25，每组5只)，在注射后0.5, 1, 2, 4和6 h将昆明小鼠断颈处死，收集血液、脑、心、肺、肝、肾、脾、大小肠、胃和肌肉等主要组织或器官，清洗、称重后使用γ计数器测量组织的放射性计数。组织的放射性摄取用百分比注射剂量每克组织(percentage injected dose per gram-tissue，%ID/g)表示。

2 结果 2.1 99mTc(CO)3-Annexin V的放射化学特点

使用Tricarbonyl kit可成功制备标记化合物99mTc(CO)3-Annexin V，标记率为(57.21±2.83)%，比活度(specific activity，SA)为(5.65±0.43) mCi/100 μg。以丙酮/甲醇混合液作为展开剂，标记产物99mTc(CO)3-Annexin V位于ITLC-SG原点(Rf=0)，标记前体[Tc(CO)3(OH2)3]+位于ITLC-SG前沿(Rf=1.0)。99mTc(CO)3-Annexin V在血清与PBS中的放化纯度在6 h分别为(91.92±0.81)%、(95.78±1.89)%，表明其在体外的稳定性良好[附公式：放射性标记率(%)=标记物总cpm数/标记放射性投入总cpm×100%)]。

2.2 生物分布

正常健康昆明小鼠生物分布结果见表 1。如表 1所示，标记化合物99mTc(CO)3-Annexin V在小鼠体内排泄较快。血液在不同时间点的放射性摄取表明99mTc(CO)3-Annexin V在体内的循环半衰期较短，即注入体内后2 h可排出约40%，4 h排出约60%。肾脏是放射性滞留最高的器官，其次为肝脏，表明99mTc(CO)3-Annexin V在活体内的主要排泄途径是肾脏和肝脏。心肌和胃肠道对99mTc(CO)3-Annexin V的摄取较低。肌肉对99mTc(CO)3-Annexin V的摄取值在各研究时间点内较低且均小于1。在所有组织中脑组织对99mTc(CO)3-Annexin V的摄取量最少。

表 1 99mTc(CO)3-Annexin V在正常健康昆明小鼠体内不同时间点的生物分布(x±s，n=5，%ID/g)
3 讨论

应用放射性核素标记Annexin V进行活体细胞凋亡显像具有快速、简单、无创等其他体内外凋亡检测方法所不及的优势。目前，已有多种放射性核素(如99mTc、18F及123I等)对Annexin V进行了标记，鉴于核素99mTc的物理性质优良(t1/2=6.02 h，发射γ射线，能量为140 keV)、获取途径简单易得、价格相对低廉等诸多优点而受到众多研究者的广泛青睐[2-4]。

使用放射性核素99mTc标记Annexin V的方法有直接和间接标记法。如若采用直接标记法，会使标记产物中产生较多变性蛋白致使肝脏放射性摄取增加，且随时间的延长标记产物放化纯度明显下降[5]。间接标记法多采用双功能螯合剂(如HYNIC、MAG3等)，目前研究中应用最多的是HYNIC[6, 7]。虽然99mTc-HYNIC-Annexin V可获得较高标记率和放化纯，但HYNIC与Annexin V的偶联过程较为繁琐复杂，且标记过程中需添加辅助协同配体EDDA和tricine，从而导致整个标记过程时间较长且标记产物稳定性欠佳；另外，HYNIC与Annexin V的偶联策略通常是N-succinimidyl-HYNIC与赖氨酸残基的氨基进行交联，这会使得蛋白分子上的21个赖氨酸残基均有可能会被交联，从而导致一个不确定的标记结果。

放射性核素99mTc可以经CO还原得到一个具有羰基核心的[99mTc(CO)3(H2O)3]+水合络离子，具有柔性的多种三齿配体能够通过交换其中的3个水分子而形成稳定性较高的配合物[8]。目前三羰基锝已广泛用于多种蛋白分子的标记，如纳米抗体、单链抗体[9, 10]。本研究中使用Tricarbonyl kit可直接制备标记前体[99mTc(CO)3(H2O)3]+化合物，其可与位于Annexin V羧基端的组氨酸标签稳定交联而形成99mTc(CO)3-Annexin V，整个标记过程可在2 h内完成且标记产物稳定性良好。

生物分布研究显示99mTc(CO)3-Annexin V在体内循环半衰期较短，这会使得背景组织对其摄取减少，从而有利于病变的显示。肾脏是放射性滞留最高的器官，其次为肝脏(6 h放射性摄取值分别为(59.90±7.53)、(29.70±8.91) %ID/g)，表明99mTc(CO)3-Annexin V在体内的主要排泄途径为肾脏和肝脏。胃肠道对99mTc(CO)3-Annexin V摄取较低，间接反映出其在体内稳定性较好，不产生游离99mTcO4-或仅产生少量99mTcO4-，从而对腹部病变的显示产生较少干扰。王荣福等采用HYNIC作为螯合剂将核素99mTc标记Annexin V，制备得到99mTc-HYNIC-Annexin V；研究结果显示肾脏是摄取放射性最高的器官，在注射显像剂后8, 24, 48和72 h，肾脏的摄取值分别为(88.00±19.00)、(86.00±7.00)、(85.00±11.00)、(80.00±16.00)%ID/g；肝脏摄取值虽然亦较高，但明显低于肾脏，其在上述时间点的摄取分别为(6.90±3.40)、(4.10±0.50)、(7.50±4.30)、(5.80±0.70)%ID/g[11]。吕中伟等将Annexin V采用亚氨基吩盐酸盐(2-IT)修饰使蛋白达到外接巯基的目的，继而再进行核素99mTc标记；兔注入显像剂后2.5 h其肾、肝和肌肉的放射性摄取值分别为(5.32±1.45)%、(0.11±0.08)%和(0.02±0.01)% ID/g[12]。采用的螯合剂不同，99mTc-Annexin V在体内的生物学行为亦存在差异，特别是在肾脏、肝脏的摄取和清除速度不同，有的甚至会影响腹部显像质量。

本研究中我们使用三羰基锝成功制备了靶向PS的分子探针99mTc(CO)3-Annexin V，标记步骤简便、标记率和放化纯较高且探针的体外稳定性良好；该探针分子量较小，血液循环半衰期较短，可从血液中快速清除；上述研究结果提示99mTc(CO)3-Annexin V是一种方便、快捷、安全的显像剂，有望实现活体内细胞凋亡的早期、无创检测，是一种非常具有临床应用前景的凋亡显像剂。

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