溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(lysosome-associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B)基因，广泛地分布于人体的多种组织中^[1]，研究表明组织内异常表达的LAPTM4B与乳腺癌及胃癌的预后具有相关性^{[2, 3]}。在前期研究中，本实验组发现LAPTM4B在前列腺癌组织中表达具有特异性，显著上调的LAPTM4B与多种前列腺癌患者的临床病理指标相关^[4]。已有研究表明在肝癌等其他肿瘤中LAPTM4B表达水平增加可促进细胞从G₁期进入S期，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭^[5]。到目前为止LAPTM4B在前列腺癌的发生发展中的生物功能报道尚少。鉴于此，本实验在体外水平通过沉默LAPTM4B基因表达，研究LAPTM4B对前列腺癌细胞增殖和转移的影响。

人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)置于K-SFM培养基(Gibco公司)中；LNCaP细胞, DU145细胞和PC-3细胞置于含有10%胎牛血清(Invitrogen公司)的RPMI 1640培养基(加拿大Life Technologies公司)中。以上细胞在37 ℃、5% CO₂孵箱内培养。

设计并合成LAPTM4B短发卡RNA(shRNA)序列，LAPTM4B shRNA的目标序列为ATGCTGTGGTACTGTTGA-TTT。将pSilencer-shRNA质粒与pSilencer^TM载体构建。细胞分为未转染组，空载体转染组和LAPTM4B shRNA转染组。用lipofectamine 2000介导转染前列腺癌细胞进行RNAi实验。在细胞转染48 h后，进行细胞克隆实验及细胞侵袭迁移实验。

使用Trizol法对不同组前列腺癌细胞中的总RNA进行提取。取2 μl RNA溶液对总RNA浓度及完整性进行检测。按反转录试剂盒(Thermo scientific)说明将各组提取的总RNA再取等量的RNA逆转录成cDNA。使用实时定量荧光PCR仪(美国ABI公司)按照试剂盒说明书以cDNA为模板, 使用LAPTM4B特定引物(上海生工生物有限公司合成)，进行PCR扩增。依据各组LAPTM4B循环阈值Ct采用2^-△△Ct结果作为测定LAPTM4B的mRNA相对表达量。

制备浓度为1.2%和0.7%两种低熔点琼脂糖液，高压灭菌后用于制备双琼脂层。1.2%琼脂糖液和20%胎牛血清的RPMI 1640培养液按1:1体积混合，取3 ml平铺培养皿。调整各种前列腺癌细胞浓度至1×10⁶/L。0.7%琼脂糖液和20%胎牛血清的RPMI 1640培养液按1:1体积混合后加入细胞悬液铺于已铺好高浓度琼脂糖液的培养皿中。每孔接种前列腺癌细胞1 000个。培养2周后显微镜下计数克隆数。

调整各组无血清前列腺癌细胞悬液浓度至2×10⁵/L，迁徙实验中将Transwell小室上层中放100 μl前列腺癌细胞悬液，下层中放含10%胎牛血清的完全培养基700 μl；侵袭实验中采用Matrigel胶包被的Transwell小室。常规培养48 h，使用0.5%结晶紫染色。拍照显微镜观察结果，随机挑选6个视野计算穿膜的细胞数，每处重复3次。

采用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料已均数±标准差(x±s)。多组间均数比较均采用单因素反差分析(One-Way ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

将RWPE-1、LNCaP、DU145和PC-3细胞中提取的RNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳。结果显示清晰的28S和18S区带且两区带灰度比约为2:1，表明提取的RNA具有较好的完整性和均一性(图 1)。经核酸定量仪测OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.7-2.0之间，表示提取的RNA纯度较好。

图 1(Figure 1)

图 1 前列腺细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳

我们使用qRT-PCR技术检测前列腺RWPE-1、LNCaP、DU145和PC-3细胞中LAPTM4B mRNA的表达水平，结果显示LNCaP、DU145和PC-3细胞中LAPTM4B mRNA水平较RWPE-1明显增高，且差异具有统计学意义(P=0.001 2)，其中LAPTM4B在PC3细胞中相对表达水平最高(图 2)。鉴于以上结果，选择LNCaP和PC-3细胞作为后续RNAi实验的细胞系。

图 2(Figure 2)

图 2 前列腺细胞LAPTM4B mRNA相对表达水平

分别提取LNCaP和PC-3细胞中未转染组，空载体转染组和LAPTM4B shRNA转染组中总RNA，利用qRT-PCR技术检测各组细胞中LAPTM4B mRNA的相对表达水平。结果显示LNCaP和PC-3细胞中LAPTM4B的表达在未转染组和空载体转染组比较没有变化，无统计学意义(P＞0.05);而LAPTM4B shRNA转染组较未转染组和空载体转染组中LAPTM4B的表达水平明显下调, 差异有统计学意义(P=0.038 3，P=0.045)如图 3中A和B。

图 3(Figure 3)

图 3 质粒转染后LNCaP和PC-3细胞LAPTM4B mRNA表达相对水平

通过体外克隆形成实验检验LAPTM4B对LNCaP和PC-3细胞增殖能力的影响。如图 4中A和B显示LNCaP和PC-3细胞中LAPTM4B shRNA转染组细胞的体外克隆形成能力明显低于未转染组和空载体转染组, 差异有统计学意义(P＜0.000 1); LNCaP和PC-3细胞中未转染组和空载体转染组细胞克隆之间无显著差别，无统计学意义(P＞0.05)。

图 4(Figure 4)

图 4 质粒转染后各组LNCaP和PC-3细胞克隆形成数示意图

通过不铺和铺人工基底膜Matrigel两种Transwell趋化小室模型来分别观察下调LAPTM4B后LNCaP和PC-3细胞迁移和侵袭能力的变化。结果如图 5和6所示, LAPTM4B shRNA转染组PC-3和LNCaP细胞到达对侧的迁移细胞数明显低于未转染组和空载体转染组，差异有统计学意义(P＜0.05)；到达对侧的迁移PC-3和LNCaP细胞数在未转染组和空载体转染组之间无统计学意义(P＞0.05)。

图 5(Figure 5)

图 5 Transwell细胞迁移实验比较各组细胞的迁移能力

图 6(Figure 6)

图 6 Transwell细胞侵袭实验比较各组细胞的侵袭能力

在本实验组的前期研究中发现LAPTM4B在前列腺癌组织中表达上调，并与前列腺癌患者的血PSA、Gleason评分、临床分期和精囊侵犯密切相关。为进一步明确LAPTM4B在前列腺癌中的表达情况，本实验对比了前列腺癌细胞系LNCaP、DU145和PC-3与人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中LAPTM4B的表达水平。结果显示三种前列腺癌系中LAPTM4B mRNA水平较RWPE-1明显增高，其中LAPTM4B在PC3细胞中相对表达水平最高。以上结果再次证明了LAPTM4B在前列腺癌中高表达。

异常表达的LAPTM4B在前列腺癌中的调控作用尚不明确。有文献报道，转染LAPTM4B的小鼠NIH3T3细胞具有在NIH小鼠体内形成纤维肉瘤的特性^[6]，LAPTM4B基因过表达可导致肝脏正常上皮细胞L02发生恶性转化^[7]。由此我们可以推断，LAPTM4B可能是调控细胞增殖、分化及恶性转化的重要因素，并在恶性转化过程中发挥重要的作用。为进一步明确LAPTM4B在前列腺癌中的生物功能，我们在下调LAPTM4B基因表达的条件下，研究LAPTM4B对前列腺癌细胞增殖、迁徙和侵袭能力的影响。人工构建shRNA LAPTM4B质粒，筛选出成功转染shRNA的前列腺癌细胞株。对比转染前后不同组前列腺癌细胞的克隆形成数，结果显示下调LAPTM4B后，前列腺癌细胞增殖能力明显下降。对比转染前后不同组前列腺癌细胞在Transwell趋化小室中到达对侧的迁移细胞数，结果显示下调LAPTM4B后，前列腺癌细胞肿瘤迁移和侵袭能力明显下降。

以上结果表明LAPTM4B基因与前列腺癌肿瘤发生发展及生物学行为密切相关，但是其生物学结构及功能尚未得到全面的揭示，详细的分子机制还需要进一步的研究。有报道发现上调LAPTM4B在子宫颈癌细胞HeLa中的表达可显著激活PI3K/AKT信号通路^[8]。我们将在进一步研究中探讨在前列腺癌中LAPTM4B发挥促进肿瘤细胞增殖和转移作用的信号通路。

综上所述，LAPTM4B在前列腺癌肿瘤中的高表达，下调的LAPTM4B在前列腺癌细胞中的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖与转移能力。LAPTM4B是一个与细胞增殖、分化乃至恶性转化调控相关的原癌基因^{[6, 7]}，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。