自闭症(Autism)是小儿广泛性发育障碍的一种亚型，主要表现为交流障碍、语言障碍、兴趣范围狭窄和刻板行为^[1]。近二十年来，其发病率由0.01%-0.02% 增加到1%-2.6%^[2]。 DNA甲基化是一种研究最为广泛的表观遗传标记，可以调控基因的差异性表达、细胞分化、胚胎发育以及基因组印记^[3]。研究发现在自闭症患者中存在CpG结合蛋白2(MECP2)，神经元特异性烯醇化酶(ENO2)，维甲酸相关孤核受体(RORA)等基因启动子区域甲基化异常改变 。这些研究表明DNA甲基化在自闭症患者发病过程中起着重要作用。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的短肽，由约60个氨基酸组成，对多种重金属有高度亲和性。MT根据其亚基组成不同分为MT1、MT2、MT3和MT4四种异构体，其中MT3与多种神经退行性疾病相关，在阿兹海默症、唐氏综合征及帕金森病中表达均发生异常改变。MT3不仅在急性脑损伤中表达异常，在大脑慢性变化和先天性异常中也起着重要作用，因此本课题组探讨MT3基因与自闭症的关系。本研究用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱仪(MALDI-TOF MS)定量检测MT3基因启动子区域部分CpG位点甲基化，并采用实时荧光定量PCR检测外周血白细胞中MT3基因的表达量，探讨MT3基因与自闭症的关系。

收集湖北武汉地区2012年1月到2014年10月间自闭症患者33人，其中男童30例，女童3例，年龄2-12岁，平均年龄(4.6±2.2)岁。经医院伦理委员会批准及其监护人知情同意，采集2 ml EDTA-Na抗凝静脉血。并收集同期于武汉大学中南医院就诊和体检的健康儿童39例，其中男童30例，女童9例，年龄2-12岁，平均年龄(5.2±3.2)岁，采集EDTA-Na抗凝静脉血2 ml作为对照。纳入标准：①由两位临床医生独立诊断，入选患者必须符合《精神障碍诊断和统计手册》第四版(DSM-Ⅳ)的诊断；②所有入选患者由临床医师根据儿童孤独症评定量表(CARS)对患儿进行评估，CARS总分大于30的患者纳入研究；③年龄在2-12岁之间。排除标准：①不符合《精神障碍诊断和统计手册》第四版的诊断；② CARS总分小于30分；③年龄大于12岁或小于2岁。③排除患有精神类疾病及Asperger's 综合征，Rett综合征、精神发育迟缓等疾病的儿童。

将收集的EDTA-Na抗凝静脉血低温4 ℃离心(2 000 g)10 min，分离血浆，置于-80 ℃冰箱保存备用。取部分血细胞用QIAmp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN,Shanghai，China)，根据说明书操作提取DNA。提取的DNA采用Nanodrop 2000紫外分光光度计(Thermo，USA)测定DNA的浓度与纯度，选取A_260/230的比值在接近1.8，A_260/230的比值在2.0附近，DNA浓度大于20×10⁶ ng/L于-20 ℃保存备用。

用EZ DNA 甲基化处理试剂盒(Zymo Research，Orange County，CA)处理DNA，按照试剂盒提供步骤操作。

采用EpiDesigner软件(http://www.epidesigner.com)设计覆盖MT3基因启动子区域的引物，上游引物为5′-AGGAAGAGAGGGTAGGGGTAGGTTTTAGGGTT-TAT-3′，下游引物5′-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTAAACAAATTCTTTC-TACCCCCAAT-3′，扩增片段大小为565 bp。亚硫酸氢盐处理的DNA采用PCR进行扩增，扩增条件为：预变性94 ℃ 4 min、94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，40个循环。扩增后的产物进行虾碱性磷酸酶SAP处理，SAP处理后的产物进行体外转录及T裂解，再进行预处理，最后采用MALDI-TOF-MS定量检测MT3启动子甲基化率。使用MassARRAY Nanodispenser(Sequenom，San Diego)从384孔板裂解反应液中取出22 μl自动装入基质芯片(Spectro CHIPs，Sequenom，San Diego)，运用MassARRAY质谱仪(Bruker-Sequenom)收集质谱图，采用Epityper v1.0.5软件(Sequenom，San Diego，CA，USA)进行分析。

用Trizol法提取RNA，提取的RNA用NanoDrop 2 000(Thermo，USA)测定其浓度及纯度。RNA用Takara公司提供的逆转入试剂盒逆转录成cDNA。引物由Primer Premier 5.0软件设计，MT3基因上游引物为5′- TGCCCCTGCCCTTCTGGT 3′，下游引物为5′-GCTTCTGCCTCAGCTGCCTC-3′。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因，上游引物为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反应体系为20 μl，其中cDNA 1.0 μl、上下游引物各0.6 μl、SYBR Green supermix(Bio-rad，Hercules，CA，USA)10.0 μl以及去离子水7.8 μl。反应条件为：95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，循环数为40。定量计算公式：2-△Ct，其中△Ct=Ct (MT3)-Ct(GAPDH)。

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，连续性变量采用 x±s 表示。每个CpG位点甲基化率分析采用Mann-Whitney U检验，运用HemI1.0软件进行聚类分析。MT3 mRNA的表达水平采用独立样本t检验。MT3基因甲基化率与mRNA表达的相关性采用Pearson秩相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

以MT3基因(转录本ENST00000200691)5′-UTR第一个碱基即转录起始位点为+1，甲基化检测设计的引物覆盖范围为-317-+247 bp。包含42CpG个位点，20个CpG单位(图 1)。通过MassARRY显示MT3基因启动子上有15个CpG 位点甲基化程度与对照组比较差异有统计学意义，其余位点差异无统计学意义，具体结果见表 1。应用聚类分析描绘自闭症患者与对照组MT3基因中20个CpG 单位甲基化水平的分布趋势，从聚类分析图(图 2)中可以看出自闭症患者甲基化水平低于对照组。

图 1(Figure 1)

图 1 检测MT3启动子序列信息 图中序列为反向序列，圆点代表CpG位点，蓝色标记的CpG位点，可以检测到。

表 1(Table 1)

表 1 MT3基因启动子各位点的甲基化率比较(x±s) CpG单位 CpG位置 甲基化率 P# 病例组 对照组 CpG 1 220 0.232±0.319 0.133±0.117 0.959 CpG 2 198 0.021±0.037 0.033±0.057 0.821 CpG 3 191 0.004±0.009 0.054±0.132 0.216 CpG 4.5.6 169,167,165 0.033±0.031 0.042±0.067 0.581 CpG 7 140 0.021±0.037 0.034±0.057 0.821 CpG 8.9.10.11 123,119,113,111 0.094±0.062 0.135±0.122 0.193 CpG 27.28.29 -10,-17,-21 0.042±0.036 0.087±0.110 0.036 CpG 30.31.32.33.34 -27,-31,-33,-35,-39 0.318±0.064 0.331±0.096 0.578 CpG 35 -56 0.146±0.155 0.145±0.129 0.806 CpG 36.37 -62,-64 0.022±0.023 0.037±0.056 0.973 CpG 39.40.41.42.43 -79,-82,-85,-92,-94 0.270±0.109 0.347±0.106 0.007 CpG 44.45.46 -114,-116,-125 0.037±0.023 0.078±0.107 0.040 CpG 47.48.49 -134,-140,-143 0.108±0.044 0.140±0.085 0.293 CpG 50 -152 0.018±0.046 0.058±0.095 0.002 CpG 51 -160 0.109±0.037 0.133±0.055 0.077 CpG 52.53 -168,-170 0.063±0.052 0.085±0.058 0.079 CpG 55 -185 0.146±0.155 0.149±0.129 0.676 CpG 56.57 -203,-210 0.261±0.069 0.325±0.085 0.003 CpG 58 -266 0.053±0.076 0.204±0.335 0.160 CpG 59 -283 0.098±0.049 0.148±0.102 0.014 #P为Mann-Whitney检验结果

表 1 MT3基因启动子各位点的甲基化率比较(x±s)

图 2(Figure 2)

图 2 MT3基因启动子甲基化水平聚类分析 图标中纵向代表每个标本，横向代表每一个CpG 单元。其中色彩反映甲基化程度：黑色代表CpG 位点未被分析，红色代表甲基化率为100%，蓝色为甲基化率为0

通过实时荧光定量PCR分析发现，MT3 mRNA相对表达水平在病例组和对照组之间有差异(P=0.002)。在自闭症患者中MT3 mRNA表达高于对照组(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 自闭症与正常对照组中MT3 mRNA表达量比较 *P＜0.05

对MT3基因甲基化率与其mRNA表达进行相关性分析显示，MT3基因CpG 39.40.41.42.43位点低甲基化与其mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.308，P=0.031)，其余位点与表达无相关性(P＞0.05)。

自闭症是一种终身性疾病，症状较轻的患者生活可以自理，较重的患者则需要终身的医疗护理，给社会和家庭带来了极大的负担，因此引起了人们的极大关注。尽管自闭症的病因不明，但是人们普遍认为大脑结构及中枢神经系统受损、遗传因素、免疫功能损伤、心理因素和环境因素与自闭症的发病机制有关。其中遗传因素和环境因素更为重要，且遗传与环境交互作用提示，表观遗传改变可能是环境暴露相关疾病的发病机制之一，因此表观遗传学在自闭症的发病因素中起着重要作用。DNA甲基化是重要的表观遗传学形式之一,与多种疾病的发生发展相关联，在自闭症中表观遗传学起着重要作用。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明可以利用DNA甲基化作为靶点治疗疾病，如5-氮杂胞苷(5-azacytidine)已成为治疗高危骨髓增生异常综合征的一线药物^[7]。MT的主要功能是转运体内金属离子，尤其是在脑组织中，MT的功能损害可以引起多种疾病，如自闭症、强迫症等^[8]。在自闭症患者中，研究发现MT蛋白及其anti-MT IgG含量增加，也有研究表明增加MT1、MT2的表达是治疗自闭症的一种新的方法^[9]。关于MT3与自闭症的关系还没有报道过，本课题组着重探索了一些CpG位点甲基化的变化及MT3基因表达与自闭症的关系。

本研究检测了MT3启动子区20个CpG单位的甲基化水平，发现多个CpG位点甲基化率在自闭症患者中低于对照组。这些结果表明，一些特殊CpG位点低甲基化在自闭症的病因中发挥了更加重要的作用。研究表明DNA 甲基化水平和环境中重金属有密切的关系^[10]，自闭症患者中体内铅、镉、镍等多种重金属元素含量升高^[11]。Takiguchi 等发现用镉处理大鼠TRL1215肝脏细胞,短时间内(1周)可以使基因组DNA 发生了低甲基化^[12]。因此，我们推测在自闭症患者中异常升高的重金属元素可以影响MT3基因的甲基化。本课题组前期实验也检测了MT3 mRNA的相对表达量，发现病例组中的表达量高于对照组，但差异没有统计学意义，可能是由于样本量过小，但在本实验中差异具有统计学意义。因此，在今后实验中该加大样本量，进一步探索MT3与自闭症的关系。研究表明，DNA异常甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。因此，我们认为MT3启动子的部分CpG位点低甲基化影响了MT3 mRNA的表达，但其具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究结果表明MT3基因启动子区位特定位点异常甲基化与自闭症相关。MT3基因启动子区低甲基化能影响其mRNA的表达，具体作用机制有待进一步研究。