肝脏移植已成为救治肝癌及晚期重症肝病病人的最佳选择。随着需要接受肝移植患者数目的增加，而供肝的数量远不能满足需求，一部分原本不符合要求的“边缘供体”(marginal organs)也开始投入使用。“边缘供体”，即老年供肝、脂肪变性供肝及心脏死亡供体(donation after cardiac death，DCD)等^[1-3]，这类器官由于获取过程中造成的损伤或潜在的质量问题，造成移植后发生移植物原发性无功能、功能延迟恢复与缺血性胆道病变的风险显著增加^{[4, 5]}。因此，我们需要更好的供肝保存技术来保证供肝的来源及质量。目前，静态冷保存(static cold storage，SCS)技术是肝移植供肝保存的常规方式^[6]，SCS主要通过将温度维持在低温(0-4 ℃)的环境下来抑制细胞代谢，并通过向灌注液中加入抗氧化物质的方法来减轻氧自由基对组织细胞的损伤^{[7, 8]}。然而，在低温状态下，肝细胞的代谢活动并未完全停止，血液供应的中断、氧气及营养物质的缺乏，均会造成细胞内无氧酵解产物及代谢废物的蓄积^[9]。与此同时，三磷酸腺苷(ATP)的产生不足会进一步破坏细胞的膜完整性、引起细胞内外电解质浓度梯度的失衡以及线粒体内钙超载等，这些均会加速细胞的损伤进程，导致细胞的凋亡和坏死^{[10, 11]}。因此，为提高移植器官的质量，确保供体移植后正常的生理功能，人们开始着眼于器官常温灌注保存的方法。因为器官常温灌注可以模拟器官的正常生理代谢状态进而减少甚至避免细胞损伤，所以受到了越来越多的关注并得到了更广泛的应用^[8]。

肝脏离体保存的过程中是否需要额外增加供氧，这个问题一直存在争议。组织在深低温状态时的需氧量很小，且0-4 ℃时细胞代谢的活力大约为正常的5%-10%。研究表明，在保存液中的氧气溶解量已可以满足器官维持代谢的耗氧需求^[12]。而另有研究则发现，即使在0-4 ℃的情况下，离体肝脏仍需要0.27 mol/(min·g)的氧气来维持基础代谢^[13]。大量研究表明，合适的氧浓度供给对于增加DCD供肝中的抗氧化物、保持ATP水平以及维持线粒体功能均具有促进作用^[13-15]。

1 肝脏常温灌注

肝脏常温灌注(normothermic perfusion，NP)即使用一个或多个离心泵，利用管道把灌注液同时泵入肝动脉与肝门静脉，并连接氧合器及加热装置的系统。此结构能达到模拟肝脏在机体内正常生理环境的目的^{[16, 17]}。

1.1 管道及参数设置

肝脏常温灌注通常采用肝动脉和门静脉双通道共同灌注的方法，也就是在手术获得肝脏时就于肝动脉及门静脉处插管。灌注肝动脉是利用离心泵向血管内直接泵入灌注液，而灌注肝门静脉则是通过把灌注液事先储存于一定高度的容器中，随后借助重力作用进行灌注^{[17, 18]}。

灌注参数包括温度、流速、压力等。灌注系统的温度一般维持在37 ℃左右。在猪DCD供肝模型中，肝动脉的压力维持在90-95 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，流量维持在0.30 L/min左右。与此同时，肝门静脉的压力维持在5-10 mmHg，流量维持在0.85 L/min左右^[19]。在人DCD供肝的灌注模型中，肝动脉的流量为(283±29) ml/min，而压力维持在50 mmHg左右；门静脉的流量为(686±25) ml/min，而压力维持在11 mmHg左右^[20]。实验室具体操作时一般在肝脏入口处和离心泵之间连接灌注液加热装置及氧合膜装置，用以保证灌注液的氧饱和度同时模拟生理状态下温度^[18]。由于动物模型的多样性及不同设备个体之间存在差异，因此在不同模型中，灌注的流速及压力的设定是不完全相同的。

1.2 灌注液

合适的灌注液应能够为肝脏代谢供应适当的氧气、营养物质和保护性物质，并维持适当的胶体渗透压，避免因灌注而造成的间质水肿。灌注液的成分及比例目前尚未统一，常温灌注多采用供体自身的血液进行灌注^{[21, 22]}，即灌注液的基础成分是稀释的、肝素化的、pH平衡的血液^[23]。准备灌注液时还需要向其中补充Ca²⁺、HCO₃^-、氨基酸、葡萄糖、胰岛素等成分^[24]。

在开始灌注后，应注意向灌注液中持续补充肝素、前列环素、葡萄糖、胰岛素、氨基酸及牛黄胆酸等成分，同时，灌注过程中可以定时对电解质浓度以及酸碱平衡状态进行检测以便在出现紊乱时及时调整。若灌注时间较长，如超过24 h，可施以广谱抗生素二联或三联用药^{[25, 26]}。Nassar等在灌注液中加入9 μg/h的环前列腺素以保持血流动力学的稳定，从而维持肝动脉和门静脉处的压力稳定^[24]。在获取大量血液有困难的或对血液成分有特殊要求的情况下，也可采用人工合成灌注液来进行常温灌注。Nui等利用一种人工合成的灌注液对猪的DCD供肝施以常温灌注9 h，研究发现这种人工合成的灌注液可以较好的模拟以血液为基础的灌注液从而提供肝脏正常代谢所需的环境^[27]。

1.3 肝脏功能评价

肝脏常温灌注系统具有在最大程度上模拟肝脏在机体内的正常生理状态的特点，这使其能够减轻肝脏的缺血损伤，同时有利于观察和获取标本，所以它可用于对肝脏的损伤程度及保存效果的评估^[28]。

一般肝脏常温灌注的评价指标包括：肝脏合成指标(白蛋白、尿素、凝血Ⅴ因子、胆汁生成率、补体等)、肝脏代谢指标(乳酸脱氢酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖含量、氧气消耗速率等)^{[29, 30]}、细胞损伤指标(AST、ALT、总胆红素、碱性磷酸酶等)、灌注液血标本检测、血流动力学指标、组织耗氧量、血气分析及肝脏组织学检查等。同时，我们也可以通过对肝门静脉和肝动脉的检测，来评估肝脏的微循环状态^[31]。

1.4 常温灌注的优势 1.4.1 避免冷缺血损伤

目前，临床常采用4 ℃的HTK (histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)液或UW (the University of Wisconsin solution)液对供肝进行保存。有研究表明，当温度每降低10 ℃时，细胞代谢率会降低1.5-2倍。然而，低温环境虽然降低了微生物的生长风险、细胞代谢速率及组织对氧的需求量，但同时也加速了ATP降解，导致Na⁺泵、Ca²⁺泵失活，加剧了有害代谢产物蓄积。同时，冷缺血更易损伤肝窦内皮细胞，还会影响细胞骨架肌动蛋白的活性并激活基质金属蛋白酶^[32]。常温灌注通过持续携氧灌注不仅能避免无氧代谢的有害产物堆积、防止冷缺血及复温带来的细胞损伤，同时也减少了ATP的大量消耗，明显提高了供肝质量^[33]。

1.4.2 延长保存时间

延长供肝保存时间有利于供肝匹配的优化，有利于为合适的移植受者带来更大的生存效益^[34]，同时能将肝移植手术由半择期手术变为择期手术，从而完善术前评估以及术前准备。不仅如此，长时间保存可使供肝在不同地区、不同移植中心之间转运，有利于更合理分配供肝^[35]。

传统冷保存的安全时限为12-18 h，这不仅严重限制了供肝转运，也使供受体的配型吻合率降低。Brockmann等^[36]将猪DCD肝脏常温机械灌注的保存时间延长到了24 h。研究表明，保存时间越长，肝脏的修复情况越好^[37]。从理论上来讲，常温机械灌注应该能够无限期地对器官进行保存，这给予了器官恢复足够的时间进行，并且避免了冷保存法在时间上具有限制性的弊端^[35]。

1.4.3 活性评估

在灌注保存的过程中，我们可以通过测量与器官功能有关的重要指标，包括生化参数、血气参数、氧气消耗速率、胆汁生成速率等，从而对该器官的功能状态进行正确评估，此过程可以有效降低移植术后并发症的发生率并提高器官的利用率^[37]。例如，肝动脉和肝门静脉的流量、压力参数可反映肝脏的微循环状态；而胆汁分泌量、耗氧率、尿素氮与Ⅴ因子的合成情况则直接反映了肝脏的功能活性。肝脏在缺血再灌注损伤过程中会产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，体外供肝的修复过程中可以采用电子顺磁共振波法定量且实时地检测供肝中ROS含量，将其作为评估供肝损伤程度的指标之一^[38]。同时，常温携氧灌注过程中还可以通过测定胆汁中碳酸氢根、胆汁酸、总磷脂的含量来判断胆道上皮细胞的功能活性^[39]，另外还可以通过测定胆汁中γ-GT及乳酸脱氢酶(LDH)的含量来评估胆道上皮细胞的受损情况^[33]。

1.4.4 保存期间的干预

在肝脏体外灌注过程中可以对器官进行干预，即在灌注期间给予药物或基因干预等其他措施来修复受损的器官，从而改善供肝功能。op den Dries等发现，在灌注液中添加亲水性胆汁酸盐可以减轻胆道缺血再灌注损伤进而减少术后胆道并发症发生的风险^[39], 而Valero等的研究表明，向灌注液中添加L-精氨酸能显著减少肝细胞及胆道上皮细胞的损伤^[40]。最近，Nassar等研究发现，灌注液中加入依前列醇钠后能够改善肝脏微循环，从而促进胆汁的分泌以及降低灌注完成后血清中ALT、AST及LDH的水平^[41]。

离体器官的基因干预更有利于目的基因转染，并且可降低病毒载体对人致病的潜在风险。因常温机械灌注是通过模拟生理条件保存供肝，所以更有利于保护性基因的转染和表达，Balogun等认为，温度为37 ℃时更有利于HO-1基因的转染和表达^[42]。

保存期间的干预措施可与多种潜在目标密切相关，这些目标包括早期纤维化基因表达的减少、免疫应答机制的变化以及缺血-再灌注损伤的修复等，这些都为移植器官的选择、干预治疗及预处理开辟了新的路径。

1.5 常温灌注的不足之处

目前，移植供肝的常温机械灌注处于动物实验阶段，还未广泛应用于临床。但已有研究证实，通过常温机械灌注来保存人类肝脏在理论上是可行的，然而该研究也同时发现只运用常温机械灌注并不能杜绝肝外胆管的缺血-再灌注损伤，研究表明体外胆汁的生成情况和其他活性参数能否准确地评估器官活性仍有待进一步考察证实^[39]。

与静态冷保存和低温机械灌注相比较，常温机械灌注装置的缺陷在于它不易携带、成本较高、操作复杂，并且技术不够成熟。不仅如此，常温机械灌注的灌注液成分及各成分所占比例尚处于研究阶段，目前还未达成一致的标准^[1]。灌注装置的复杂性使常温机械灌注极易发生故障造成肝脏代谢紊乱，血液供应的短缺也使常温下稀释血液的灌注在临床应用时受到限制，而其他携氧物质(人造血红蛋白液等)的作用还有待评估。而且在常温条件下，灌注液中加入的营养物质虽然满足了细胞代谢的需求，但也同时增加了微生物生长的风险，向灌注液中添加抗生素也不能完全避免感染^[43]。

2 携氧技术在常温灌注中的运用

氧是细胞正常进行各项生理活动的原动力，更是生成ATP的必要物质之一。在获取肝脏的过程中，一旦血流的供应被阻断，营养物质和氧气等便会相继停止供应。而ATP的持续耗损会引起细胞膜两侧电解质浓度差消失和Na⁺泵、K⁺泵的失功，进而引发磷酸酶活化、细胞水肿以及钙离子内流，这些最终均会导致炎症的发生及细胞的凋亡坏死^[44]。缺氧、缺血的情况若一直没有得到改善，黄嘌呤脱氢酶便转化为黄嘌呤氧化酶，而氧气在再灌注阶段恢复充入的时候，黄嘌呤氧化酶会把蓄积的酸性代谢产物转化为次黄嘌呤、黄嘌呤和活性氧自由基等，它们都可能使脂质过氧化甚至导致细胞破坏^[45]。而对DCD供肝而言，在供肝的血流阻断和肝脏灌洗的过程之间还存在额外的热缺血时间，这会引起更久的缺血、缺氧及更为严重的ATP损耗。

如今，最常见的携氧方式是在灌流液中利用氧合器实施氧合，按照氧合机制的不同，氧合器可以进一步分为膜式氧合器和鼓泡式氧合器。对DCD或ECD供肝来说，现在普遍认为增添额外的氧气有助于进行供肝保存，总计为412 mmHg的氧分压便可以满足肝脏代谢需求^[46]。由于肝脏由肝门静脉(35%)和肝动脉(65%)同时供氧，有学者认为肝动脉268 mmHg和门静脉144 mmHg的氧分压符合肝脏耗氧的生理需求^[47]。

3 展望

近年来，由于现有的静态冷保存技术的限制以及“边缘供体”的开放使用，人们纷纷致力于钻研新的保存技术，而常温携氧灌注对DCD供肝的修复和保存作用使它成为目前肝移植研究的热点。常温携氧灌注通过模拟供氧、温度等条件来模拟肝脏在机体内的正常生理状态，所以它不仅能保证肝脏的正常代谢，同时具备修复损伤的功能。与亚常温机械灌注和低温机械灌注相比，常温携氧机械灌注已渐渐显示出其独特的优势，是一种良好的保存技术。

目前，常温灌注已被应用于离体肝脏的保存以及在器官获取过程中的维持灌注。随着常温机械灌注装置的逐渐改进与不断完善，灌注参数和灌注液的不断优化，体外常温携氧机械灌注有望作为一种新型的器官保存和修复手段，为“边缘供肝”的应用提供更多机会，进而起到缓解器官短缺的作用。然而，常温携氧灌注技术复杂、费用高昂，目前还不够成熟，因此，其临床应用还不够普遍，且效果尚不确切^{[3, 48, 49]}。我们有理由相信随着系统稳定性及便携性的改善，常温携氧灌注对器官保存及修复的优势会得到进一步的凸显。