呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)属副黏病毒科，肺病毒属，单股负链RNA病毒，是婴幼儿和儿童季节性上呼吸道感染常见的病原体，也是世界范围内引起儿童下呼吸道病毒感染性疾病的最常见原因，表现为毛细支气管炎和病毒性肺炎。RSV感染在老年和免疫功能不全的人群中具有很高的发病率及死亡率^{[1, 2]}。

利巴韦林(ribavirin)是一种人工合成的鸟苷类衍生物，为单磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)脱氢酶抑制剂，通过抑制IMP阻碍病毒核酸的合成，但对病毒无直接灭活作用。体内外研究已证实它对RSV复制有很强的抑制作用^[3]。美国儿科学会不推荐常规使用利巴韦林，但在严重RSV感染或具有高危因素的RSV感染患儿可以考虑应用^[4]。回顾性研究表明，造血干细胞移植及实体器官移植者RSV感染时，无论口服、雾化吸入及静脉使用利巴韦林均可以降低疾病的风险^{[1, 4, 5]}。由于其对多种RNA、DNA病毒有效，在临床上得到了广泛应用。虽然利巴韦林能够有效的抑制RSV复制，但能否调节细胞凋亡从而影响疾病的病理过程尚不清楚。本文通过研究利巴韦林干预后RSV感染的A549细胞pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白表达的变化，进一步认识利巴韦林的作用机制，为临床应用提供一些新的思路。

人肺腺癌细胞A549由武汉大学中南医院医学科学研究中心保存，RSV A2株来源于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，利巴韦林注射液(湖北天药药业，批号:11312151)，Phospho-Akt (Ser473)兔抗人单克隆一抗、Akt兔抗人单克隆一抗、IκBα兔抗人单克隆一抗、Bax兔抗人单克隆一抗、Bcl-2兔抗人单克隆一抗、β-actin兔抗人单克隆一抗及辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology)。

将A549细胞培养于含10%胎牛血清及双抗(青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃，5%CO₂培养箱中培养，待细胞长满单层时进行传代。取对数生长期细胞接种于6孔板中，待细胞融合至80%时进行分组处理。

待A549细胞生长至60%融合时接种RSV A2株，室温摇床吸附60 min后加入含2%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃，5%CO₂培养箱培养3-5 d。待90%细胞出现融合病变后，反复冻融3次收获病毒原液。留取部分测病毒滴度其余分装冻存备用。

细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM培养基，病毒接种液与含药液均用细胞维持液稀释，对照液为含与病毒原液等量的PBS的细胞维持液。本研究结合文献报道的利巴韦林体外抗RSV的最佳作用浓度、作用环节及利巴韦林对A549细胞的最大无毒浓度，采用100 μg/ml终浓度的利巴韦林进行实验^[3]。

将A549细胞分为4个组:①细胞对照组(C组):接种对照液，37 ℃，5%CO₂培养箱内吸附1 h，弃对照液，加入不含利巴韦林的细胞维持液继续培养。②利巴韦林组(Rib组):接种对照液，37 ℃，5%CO₂培养箱内吸附1 h，弃对照液，加入含利巴韦林的细胞维持液培养。③呼吸道合胞病毒组(RSV组):接种含RSV (MOI=3)的病毒液，37 ℃，5%CO₂吸附1 h，弃接种的病毒液，加入不含利巴韦林的细胞维持液培养。④利巴韦林干预组(RR组):接种含RSV (MOI=3)的病毒液，37 ℃，5%CO₂吸附1 h, 弃接种的病毒液，加入含利巴韦林的细胞维持液培养。各组实验同时进行，在RSV感染后的1, 2, 4, 12, 24 h收集RSV组和RR组培养上清，空斑实验检测各时间点病毒滴度；收集各组细胞，应用Western-blot技术检测pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白的表达。

将A549细胞按照5×10⁵/ml密度接种于12孔板，每孔1 ml。置37 ℃，5%CO₂培养箱培养，待细胞生长至单层后，吸去培养基，PBS清洗2次，每孔加入维持液500 μl。用2%DMEM (维持液)10倍倍比稀释病毒原液。每孔加入50 μl稀释好的病毒原液，每个稀释度做2个复孔，充分混匀后置于37 ℃，5%CO₂培养箱中吸附2 h。弃吸附液，每孔添加覆盖层(3%琼脂糖)1 ml，置于37 ℃，5%CO₂培养箱中培养3-4 d，之后每孔添加约2 ml的1%甲醛。固定过夜使其充分渗透到覆盖层，固定时间至少24 h。剔除覆盖层，每孔添加0.05%中性红溶液2 ml，室温染色1-24 h后吸掉染液，用自来水清洗，室温干燥，计数红色背景中没有着色的“空斑”。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，病毒悬液的滴度用每毫升空斑形成单位(pfu)来表示。

提取细胞总蛋白，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃变性5 min，BCA法测定蛋白浓度。配制12%分离胶及5%浓缩胶进行蛋白电泳，转膜200 mA，90 min。一抗孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗(1:5 000), 室温摇床90 min，ECL发光、压片、显影和定影。扫描图像，定量分析光密度值。以目的条带与β-actin光密度比值作为目的条带的相对表达量。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

RSV组病毒滴度持续升高，24 h升至1.0×10⁵ pfu/ml；而RR组在培养的24 h内，病毒滴度较低，在1.0×10³-1.1×10³pfu/ml之间波动(图 1)。提示利巴韦林可以有效的抑制RSV复制。

图 1(Figure 1)

图 1 RSV组和RR组培养上清中病毒滴度的变化

Rib组与C组相比，pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白表达变化不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。说明利巴韦林对正常A549细胞中的pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白表达没有影响(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 C组和Rib组pAKT、AKT、IκBα、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平

AKT蛋白在RSV组和RR组中表达恒定。RSV组，随着病毒感染时间的延长，pAKT蛋白的表达在1 h达到高峰，2 h略下降，2-24 h内表达变化不明显。RR组，随着利巴韦林干预时间的延长，pAKT表达显著增加，在2 h升高最明显，2，4，12，24 h表达均高于RSV组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 3)。显示利巴韦林作用后可上调pAKT蛋白表达，并在24 h内持续高表达。

图 3(Figure 3)

图 3 RSV组和RR组pAKT、AKT蛋白的表达水平 RSV组比，*P＜0.05

RSV组，随着病毒感染时间的延长，IκBα蛋白表达逐渐增加。RR组，IκBα蛋白表达无明显变化，2 h表达与RSV组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，4，12，24 h表达均低于RSV组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 4)。显示利巴韦林作用后可以抑制IκBα蛋白的表达。

图 4(Figure 4)

图 4 RSV组和RR组IκBα蛋白的表达水平 与RSV组比，*P＜0.05

RSV组，随着病毒感染时间的延长Bax蛋白表达逐渐增加，4 h达到高峰，4 h至24 h表达无明显变化。RR组Bax蛋白表达明显减少，在2, 4, 12, 24 h表达均低于RSV组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 5A)。RSV组Bcl-2蛋白表达先升高后降低，4 h增加最明显。RR组Bcl-2蛋白12 h、24 h表达高于RSV组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 5B)。显示利巴韦林作用后可抑制Bax蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白表达。

图 5(Figure 5)

图 5 RSV组和RR组Bcl-2、Bax蛋白的表达水平 与RSV组比, *P＜0.05

PI3-K/AKT信号转导途径在细胞凋亡、存活、增殖以及细胞骨架变化的生物学功能中具有重要的调节作用，是细胞内重要的信号转导通路。PI3-K/AKT通路可以通过激活其下游诸多抗凋亡因素如:NF-κB、Bcl-2、Bcl-xL等，同时抑制一系列促凋亡因素如:FasL、caspase、Bax、p53等起到抗细胞凋亡的作用，Akt-NF-κB是其中一条重要的途径。本研究发现利巴韦林作用1 h即可引起pAKT蛋白表达增加，并在24 h内持续高表达。提示在RSV感染A549细胞的24 h内，利巴韦林作用后可使PI3-K/AKT通路持续激活。AKT激活后可以活化IκB激酶(IκB kinase, IκK)，从而使IκB磷酸化。IκB (inhibitor of nuclear factor kappa-B)是核因子kappaB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)的抑制蛋白，其中IκBα是IκB家族中抑制NF-κB活性的最重要成分。在静息状态下，IκBα与NF-κB杂二聚体以结合形式位于细胞质中，抑制NF-κB的核转位。当各种刺激因子(如病毒蛋白、细胞因子、脂多糖、氧自由基)刺激细胞时，IκB激酶复合物被级联信号迅速激活。活化的IκK能磷酸化IκBα N端的32、36位丝氨酸残基，磷酸化的IκBα(Phospho-IκBα)21、22位赖氨酸被泛素连接酶泛素化，已磷酸化并泛素化的IκBα进而被26S蛋白小体降解并脱离NF-κB。IκBα的降解使NF-κB的核定位信号(nuclear localization dignal，NLS)暴露，促进NF-κB磷酸化及核转位。IκBα不仅可以抑制NF-κB的活化，还可反馈调节NF-κB系统。IκBα主要结合NF-κB的P65和P50亚基，当IκBα被磷酸化后分解，P65和P50亚基才能解离激活，P65活化后又可以上调IκBα的表达^[6-8]。所以当刺激开始的时候IκBα下调，经过一定时间之后IκBα恢复，并与NF-κB结合使之失活。Lindemans等研究发现RSV (MOI=5)感染中性粒细胞10 min和30 min后均有IκBα的显著降解，从而导致NF-κB的激活^[9]。本研究发现利巴韦林作用后可以抑制IκBα蛋白的表达。提示利巴韦林在作用后可能抑制P65对IκBα的反馈调节，使NF-κB通路持续激活而发挥抗凋亡作用。

NF-κB激活后可通过上调抗凋亡基因(如Bcl-2家族)的表达，抑制细胞凋亡的线粒体途径或死亡受体途径。Bcl-2蛋白家族(Bcl-2 family of proteins)是调节线粒体通透性的主要成分，通过形成同源和异源二聚体对细胞凋亡进行调控。Bcl-2/Bax异源二聚体抑制细胞凋亡，Bax/Bax同源二聚体促进细胞凋亡。本研究发现利巴韦林作用后可抑制Bax蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白表达。说明利巴韦林可以上调抗凋亡基因Bcl-2、下调凋亡基因Bax，从而抑制RSV感染的宿主细胞发生凋亡。

有研究表明RSV感染A549细胞后8 h虽可以检测到细胞凋亡，但细胞在24 h才出现明显凋亡^[10]。本研究在RSV感染A549细胞后加入利巴韦林，证实利巴韦林可以激活AKT-NF-κB途径、上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达，有利于A549细胞朝着生存的方向发展。说明利巴韦林的抗病毒作用，不仅表现在可以抑制RSV的复制，同时可以保护RSV感染的宿主细胞并有利于其存活，避免了宿主组织细胞发生严重损伤，限制了疾病的病理过程，为利巴韦林的临床应用价值提供了有利依据。