武汉大学学报(医学版)   2016, Vol. 37Issue (2): 183-186   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.003.
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引用本文 

许朝龙, 邬善敏, 苗志钊, 李蔚, 赵凯亮. 小檗碱对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体能量代谢的保护作用[J]. 武汉大学学报(医学版), 2016, 37(2): 183-186. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.003.
XU Chaolong, WU Shanmin, MIAO Zhizhao, LI Wei, ZHAO Kailiang. Protective Effect of Berberine on Mitochondrial Energy Metabolism of Liver in the Rat with Obstructive Jaundice[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2016, 37(2): 183-186. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.003.

作者简介

许朝龙，男，1989-，医学硕士生，主要从事肝胆外科基础与临床研究

通讯作者

邬善敏，男，1963-，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事梗阻性黄疸的基础与临床研究

文章历史

收稿日期：2015-05-25
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小檗碱对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体能量代谢的保护作用
许朝龙 , 邬善敏 , 苗志钊 , 李蔚 , 赵凯亮     
武汉大学人民医院肝胆腔镜外科 湖北 武汉 430060
收稿日期：2015-05-25
作者简介：许朝龙，男，1989-，医学硕士生，主要从事肝胆外科基础与临床研究
通讯作者：邬善敏，男，1963-，医学博士，教授，硕士生导师，主要从事梗阻性黄疸的基础与临床研究
[摘要] 目的: 探讨小檗碱(BBR)对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体能量代谢的保护作用及其机制。 方法: 将雄性Wistar大鼠45只随机分为3组，A (Sham)组：假手术组；B (BDL)组：胆道结扎组；C (BDL+BBR)组：胆道结扎同时小檗碱干预组。术后7 d取血清检测总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，检测肝细胞线粒体内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、ATP、ADP和AMP含量并计算能荷(EC)，Western blot检测肝组织AMPK、PGC-1α表达。 结果: B组与A组比较：血清ALT、AST含量升高，肝组织p-AMPK、PGC-1α表达下降，肝细胞线粒体内MDA、AMP含量升高，SOD、ATP、ADP、EC含量降低(P＜0.05)；C组与B组比较：血清ALT、AST含量降低，肝组织p-AMPK、PGC-1α表达升高，肝细胞线粒体内MDA、AMP含量降低，SOD、ATP、ADP、EC含量升高(P＜0.05)。 结论: 小檗碱可能通过激活AMPK/PGC-1α信号途径，减轻梗阻性黄疸时肝细胞氧化损伤，改善能量代谢。
关键词： 小檗碱    梗阻性黄疸    AMPK    PGC-1α    能量代谢    SOD    MDA    
Protective Effect of Berberine on Mitochondrial Energy Metabolism of Liver in the Rat with Obstructive Jaundice
XU Chaolong, WU Shanmin, MIAO Zhizhao, LI Wei, ZHAO Kailiang     
Dept. of Hepatobiliary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
[Abstract] Objective: To investigate the protective effect of berberine (BBR) on mitochondrial energy metabolism of liver in the rat with obstructive jaundice. Methods: Forty five rats were divided randomly into groups of sham operation (Sham, group A), bileduct-ligation (BDL, group B) and bileduct-ligation (BDL+BBR, group C). All rats were sacrificed on the 7th day after BDL and the blood and liver tissue samples were obtained.The levels of serum ALT, AST, TBIL, DBIL and the levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), ATP, ADP, AMP in rat liver's mitochondrion were detected.The expression of the AMPK and PGC-1α proteins were analyzed by Western blotting. Results: Compared with those in group A, the levels of the p-AMPK and PGC-1α proteins, SOD, ATP, ADP, EC were lower (P < 0.05), but the ALT, AST, MDA, AMP were higher in group B (P < 0.05). The levels of the p-AMPK and PGC-1α proteins, SOD, ATP, ADP, EC were higher (P < 0.05), while the ALT, AST, MDA, AMP were lower (P < 0.05) in group C than in group B. Conclusion: The BBR can protect the liver from the peroxide damage and improve mitochondrial energy metabolism by activating AMPK/PGC-1α pathway.
Key words: Berberine    Obstructive Jaundice    AMPK    PGC-1α    Energy Metabolism    SOD    MDA    

小檗碱(Berberine，BBR)是从黄连、黄柏等植物中提取分离得到的一种生物碱，在治疗糖尿病、心血管疾病、肿瘤、炎症、细菌和病毒感染等多方面具有药理作用[1]，近年来研究表明，小檗碱对化学性肝损伤、脂多糖性肝损伤及梗阻性黄疸肝损伤有保护作用[2-4]。但小檗碱对梗阻性黄疸肝细胞能量代谢保护作用的报道较少。我们通过小檗碱干预梗阻性黄疸大鼠，检测肝组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、过氧化物酶体增殖激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha, PGC-1α)表达变化，探讨BBR对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体内能量代谢的保护作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 材料

BBR购自阿拉丁公司，纯度≥99%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，用生理盐水配制成适宜浓度; 山羊抗大鼠AMPK抗体、兔抗大鼠p-AMPK抗体购于Santa Cruz公司，兔抗大鼠PGC-1α抗体购于Thermo公司，小鼠抗大鼠β-actin抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗羊二抗、羊抗兔二抗及羊抗小鼠二抗均购于武汉博士德生物工程有限公司; 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒及牛血清白蛋白购于南京建成生物工程研究所。冷冻离心机(国产D4-2A型)、高压液相色谱仪(Waters，美国)。

1.2 动物分组及模型的建立、标本取材

健康雄性Wistar大鼠45只，体质量220-250 g，由湖北省疾控中心提供，随机分为3组，每组15只：A组(假手术组、Sham组)、B组(梗阻性黄疸组、BDL组)、C组(梗阻性黄疸+小檗碱干预组、BDL+BBR组); 模型建立：大鼠麻醉后，取上腹部正中切口，A组：暴露胆总管但不结扎不横断，关腹，B、C组：暴露胆总管，以4-0号丝线双重结扎，于两结扎线间离断，确定无胆漏后关腹; 其中C组大鼠于术后12 h开始予以18 mg/(kg·d) BBR腹腔注射，A、B组大鼠于术后12 h开始予以等量生理盐水腹腔注射; 建模后第7天取血后处死，取一部分肝组织分离提取线粒体，供能量物质检测，另取一部分用4%多聚甲醛固定，进行后续检测。

1.3 肝功能检测及病理学观察

各组大鼠血液标本静置、离心后收集血清，采用全自动生化分析仪检测总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，肝组织石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肝脏形态学变化。

1.4 肝细胞线粒体内三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、能荷(EC)测定：高效液相色谱法测定。 1.4.1 大鼠肝线粒体的分离提取

大鼠处死后，快速取肝组织0.5 g置于冷(4 ℃)生理盐水中漂洗，移入预冷的分离介质，手工组织匀浆，以4.5 ml分离介质悬浮，差速离心法分离线粒体，将线粒体沉淀用分离介质洗2次，按10 mg/ml悬浮于分离介质中制成线粒体悬液。以上操作均在0-4 ℃中完成。按Lowry法测定线粒体蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准。

1.4.2 线粒体内腺苷酸含量测定

取0.1 ml线粒体悬液加入冰冷的1.6 mol/L的HClO4 0.2 ml，0 ℃静置5 min后于12 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液用2.5 mol/L的K2CO3中和(调pH至6.5-7.0)，充分混合，于0 ℃静置10 min后再次于12 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液20 μl行高压液相色谱分离并测定ATP、ADP、AMP含量。结果以nmol/mg线粒体蛋白表示，并计算能荷[EC=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)]。

1.5 线粒体内SOD、MDA水平测定

取线粒体悬液，参照试剂盒说明，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定线粒体内MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定线粒体内SOD活性。

1.6 Western blot检测肝组织AMPK、PGC-1α表达

肝组织经BCA法测定蛋白含量，行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。TBST充分洗涤PVDF膜后，行ECL发光、显影、定影处理，图像分析蛋白条带。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析，所得数据用均数±标准差(x±s)表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 光镜结果

造模后7 d，肝细胞出现肿胀、变性、点状坏死，肝小叶周围可见炎性细胞浸润，少量纤维组织及小胆管增生，C组肝组织病理改变较B组轻。

2.2 大鼠血清TBIL、DBIL、ALT、AST检测结果

B、C组的TBIL、DBIL、ALT、AST水平均高于A组(P＜0.05)，B、C组的TBIL、DBIL水平差异无明显统计学意义(P＞0.05)，而C组的ALT、AST水平明显低于B组(P＜0.05)，见表 1。

表 1 实验大鼠血清TBIL、DBIL及ALT、AST检测结果
2.3 大鼠肝线粒体SOD、MDA检测结果

B组SOD水平低于A组，而MDA高于A组，差异有统计学意义(P＜0.05); C组SOD高于B组，MDA水平低于B组(P＜0.05)，见表 2。

表 2 实验大鼠肝线粒体SOD、MDA检测结果
2.4 大鼠肝细胞线粒体ATP、ADP、AMP、EC检测结果

B组ATP、ADP、EC含量低于A组，AMP含量高于A组，差异有统计学意义(P＜0.05); C组ATP、ADP、EC含量高于B组，AMP含量低于B组(P＜0.05)，见表 3。

表 3 实验大鼠肝细胞线粒体ATP、ADP、AMP、EC检测结果
2.5 大鼠肝组织AMPK、PGC-1α蛋白表达水平

B组p-AMPK、PGC-1α蛋白含量低于A组，差异有统计学意义(P＜0.05); C组p-AMPK、PGC-1α蛋白含量高于B组(P＜0.05)，见图 1。

图 1 各组肝脏AMPK、PGC-1α蛋白Western blot结果 B组与A组比较，*P＜0.05;C组与B组比较，#P＜0.05
2.6 肝细胞中PGC-1α蛋白表达水平与线粒体MDA、SOD水平的相关性分析

B组中PGC-1α蛋白表达下降，SOD活性下降，MDA含量升高，而C组中PGC-1α蛋白表达增加，SOD活性增加，MDA含量降低，分析表明肝细胞内PGC-1α蛋白的表达水平与肝细胞线粒体内MDA的水平呈负相关(r=-0.716、P＜0.01)，而与肝细胞线粒体内SOD的水平呈正相关(r=0.762、P＜0.01)。

3 讨论

梗阻性黄疸是比较常见的肝胆外科疾病，可以通过多种方式引起肝细胞损伤，其主要环节为能量代谢障碍、脂质过氧化损伤。线粒体是细胞能量代谢的中心场所，由线粒体损伤所致的肝细胞能量代谢障碍是肝功能损害的重要原因[5]。有研究证实，胆盐和胆汁酸可通过细胞毒作用直接损伤线粒体[6]，使肝细胞线粒体的氧化磷酸化活性降低，导致产能障碍。梗阻性黄疸时，血浆内毒素使肝细胞Na+-K+-ATP酶活性降低，直接干扰肝细胞能量代谢，并且内毒素持续刺激库普弗细胞，使其过度活化，分泌大量细胞因子和炎性介质，促进氧自由基生成，抑制线粒体呼吸功能。

MDA是脂质过氧化物的最终代谢产物，是反映脂质过氧化损伤的可靠指标。SOD是生物体内的一种天然抗氧化剂，可清除超氧阴离子自由基，降低MDA的产生，保护细胞免受氧化损害。线粒体是体内调节氧化和抗过氧化应激平衡的重要细胞器，也是SOD的主要生成场所。本研究表明，胆道梗阻后肝细胞线粒体内MDA明显升高，SOD含量明显减少(P＜0.05)，肝细胞线粒体ATP、EC含量降低(P＜0.05)，EC是反映肝细胞能量代谢储备功能的重要指标，而小檗碱组较梗阻性黄疸组MDA含量明显降低，SOD含量明显升高(P＜0.05)，ATP、EC含量升高(P＜0.05)，说明小檗碱可以通过降低肝细胞线粒体内MDA含量和增加SOD含量，减轻梗阻性黄疸时氧自由基对肝细胞的损害，保护肝细胞能量代谢。

AMPK是真核细胞生物中广泛存在的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与生物体内多种代谢过程，被称为“细胞能量调节器”，它是由催化亚基α和调节亚基β、γ组成的异源三聚体，其中α亚基172位点苏氨酸的磷酸化为AMPK激活所必需; 一旦172位点苏氨酸磷酸化，AMPK被激活为有活性的p-AMPK形式，就能调节下游蛋白激酶或调控各种基因表达，从而影响机体的能量代谢。PGC-1α是促进线粒体生物合成的主要调节因子，在能量合成和防止过氧化应激过程中发挥重要作用[7]。研究显示BBR是强有力的AMPK激动剂[8]，AMPK被磷酸化激活后，能诱导PGC-1α表达增加，引起线粒体氧化磷酸化能力增强，打开ATP产能的生成途径[9]。本研究发现，BDL组AMPK活性降低，PGC-1α表达减少(P＜0.05)，肝脏能量代谢明显异常，肝细胞线粒体ATP含量降低，BDL+BBR组AMPK活性升高，PGC-1α表达增加(P＜0.05)，ATP含量升高，表明BBR通过激活AMPK，增加PGC-1α表达，保护肝细胞能量代谢。

对肝细胞内PGC-1α蛋白的表达水平与肝细胞线粒体内MDA、SOD水平的相关性分析发现，肝细胞内PGC-1α蛋白的表达水平与肝细胞线粒体内MDA的水平呈负相关，而与肝细胞线粒体内SOD的水平呈正相关。由此我们可以认为，在梗阻性黄疸中BBR可能通过激活AMPK，增加PGC-1α表达，一方面直接促进线粒体生物合成，增强线粒体氧化磷酸化能力，增加ATP生成，另一方面通过降低肝细胞线粒体内MDA含量和增加SOD含量，减轻梗阻性黄疸时的脂质过氧化损伤，保护肝细胞能量代谢。

参考文献
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