2017, Vol. 38
2. 武汉大学HOPE护理学院 湖北 武汉 430071
2. Wuhan University HOPE School of Nnursing, Wuhan 430071, China
CD1分子属于非多态性基因家族，由5个不同基因组成。它分为两群：一群分子在人类表达，即CD1a、CD1b、CD1c和CD1e分子；另一群分子在人类和鼠均表达，即CD1d分子。树突细胞 (dendritic cells, DCs)、巨噬细胞和B淋巴细胞等抗原递呈细胞均表达CD1d分子[1]。目前认为最主要的CD1d限制性细胞是自然杀伤 (natural killer, NK) T细胞，它兼具NK细胞和T细胞特征。NKT细胞表达CD1d限制性T细胞抗原受体 (T cell receptor，TCR)。根据T细胞抗原受体 (TCRs) 特征，NKT细胞分为Ⅰ型NKT细胞 (又称为恒定NKT细胞，iNKT细胞) 和Ⅱ型NKT细胞[2]。研究显示Ⅰ型NKT细胞参与哮喘气道炎症和气道高反的形成[3]。CD1d/NKT细胞受体相互作用诱导NKT细胞产生大量Th1和Th2类细胞因子，如白介素 (IL)-4、IL-5、IL-13、肿瘤坏死因子 (TNF)、干扰素 (IFN)-γ等，在体内阻断CD1d/NKT细胞通路可能调节这些细胞因子的释放[4]。目前不清楚阻断CD1d/Ⅰ型NKT细胞通路是否抑制哮喘气道炎症，因此本文探讨抗CD1d单克隆抗体对哮喘小鼠气道炎症的影响，并观察抗CD1d单克隆抗体对小鼠肺Ⅰ型NKT细胞数量和活性的影响，从而为哮喘治疗提供新的途径。
1 材料与方法 1.1 实验动物6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自于武汉大学动物实验中心。在无特定病原菌 (specific pathogen free，SPF) 环境下饲养。
1.2 实验试剂鸡卵清白蛋白 (ovalbumin，OVA，Grade V)，美国Sigma公司；免疫佐剂 (Inject Alum)，美国Thermo公司；抗CD1d单克隆抗体，eBioscience公司；快速瑞氏-姬姆萨复合染液试剂盒 (Wright-Giemsa)，江苏南京建成生物工程研究所；Ⅰ型胶原酶，Invitrogen公司；ELISA试剂盒 (IL-4，IL-5，IL-13，OVA-specific IgE)，eBioscience公司；PE标记的PBS-57/小鼠CD1d四聚体由美国国立卫生研究院赠送；固定剂、破膜剂、Brefeldin A、PE-cy5标记的TCR-β、FITC标记的IL-4及IFN-γ均购自eBioscience公司。
1.3 小鼠哮喘模型的制备及干预小鼠随机分为抗CD1d单克隆抗体组 (抗CD1d mAb组)、哮喘组和对照组，每组5只。哮喘组和抗CD1d单克隆抗体组第0、14天，每只小鼠腹腔注射20 μg OVA (含2 mg氢氧化铝佐剂)，第25、26、27天，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，经鼻腔给予100 μl OVA激发，对照组采用等体积PBS代替。在首次激发前1 h，抗CD1d单克隆抗体组每只小鼠尾静脉注射50 μg抗CD1d单克隆抗体，对照组和哮喘组给予等体积PBS代替。
1.4 标本的收集和处理与细胞学、组织学检测各组小鼠于末次激发24 h后，对小鼠进行眼球取血。分离血清，分装，-80 ℃保存，用于检测血清OVA特异性IgE。随后钝性分离暴露气管，在甲状软骨处插入静脉留置针，用含有1 mmol/L EDTA的冷PBS缓冲液0.5 ml灌洗3次，回收率在80%以上为合格 (总体积>1.2 ml)。支气管肺泡灌洗液 (BALF) 置于4 ℃离心，1 200 r/min，10 min。收取上清液，-80 ℃保存，用于检测IL-4，IL-5和IL-13水平。用含有1%FBS的PBS操作液重悬BALF中细胞沉淀，调节细胞浓度为1×106个/ml，取100 μl于细胞涂片离心机上甩片，500 r/min，1 min。待玻片晾干后，进行瑞氏-姬姆萨染色。取左肺组织，以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE和PAS染色，观察肺组织炎症和气道基底膜PAS阳性细胞 (杯状细胞)。
1.5Ⅰ型NKT细胞数量和活性测定取右肺组织，充分切碎，Ⅰ型胶原酶消化，通过300目细胞滤网过滤获得肺组织单细胞混悬液，以密度梯度离心法分离肺组织单细胞混悬液中单个核细胞 (MNCs)，调整浓度为1×106/ml，加入PE标记的PBS-57/小鼠CD1d四聚体复合物，4 ℃，避光，40 min。再加入PE-Cy5标记的TCR-β，4 ℃，避光，20 min。流式细胞术检测PBS-57/小鼠CD1d四聚体+TCR-β+细胞，即为Ⅰ型NKT细胞。以Ⅰ型NKT细胞分泌的细胞因子IL-4和IFN-γ水平作为评价其活化状态的指标。胞内细胞因子检测时，肺MNCs需经佛波酯 (PMA，50 μg/L) 和离子霉素 (Ionomycin，500 μg/L) 刺激2 h后，加入1 mg/L Brefeldin A阻断剂，37 ℃培养箱孵育4 h。随后收集细胞，同上述表面染色后固定破膜，随后加入FITC-IL-4和FITC-IFN-γ，室温，避光，20 min。破膜剂1-2 ml洗涤细胞一次，400 μl PBS重悬细胞后上机检测。
1.6 血清OVA特异性IgE和BALF中细胞因子的检测采用ELISA法检测小鼠血清OVA特异性IgE水平，结果以OD值表示相对水平。参考试剂说明书，采用ELISA法检测BALF中的IL-4、IL-5和IL-13水平。
1.7 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差 (x±s) 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组HE和PAS染色采用HE和PAS染色评估小鼠气道炎症浸润和杯状细胞增生程度。对照组小鼠肺组织无炎症表现，气道基底膜上无PAS染色阳性细胞 (杯状细胞)；哮喘组小鼠肺组织炎性浸润明显，气道基底膜上可见大量PAS阳性细胞；与哮喘组比较，抗CD1d单克隆抗体组小鼠肺组织炎症浸润明显减轻；气道基底膜上PAS阳性细胞明显减少，两组间比较差异有统计学意义 (P＜0.01)(图 1、图 2)。
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图 1 各组肺组织HE染色和PAS染色 |
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图 2 各组支气管上皮细胞中PAS染色阳性细胞数相对面积 与哮喘组比较，**P＜0.01 |
对照组小鼠BALF中细胞以巨噬细胞为主，少许淋巴细胞，未检测到嗜酸粒细胞、中性粒细胞。哮喘组小鼠BALF中细胞总数、巨噬细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数均显著高于对照组；抗CD1d单克隆抗体组小鼠BALF中细胞总数及巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞计数明显低于哮喘组 (均P＜0.01)(图 3)。
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图 3 各组BALF中细胞总数和分类计数比较 BALF，支气管肺泡灌洗液；Tol，细胞总数；Eos，嗜酸粒细胞；Mar，巨噬细胞；Neu，中性粒细胞；Lym，淋巴细胞；数据以x±s表示，两组间比较，**P＜0.01 |
对照组小鼠中未检测到OVA特异性IgE。哮喘组和抗CD1d单克隆抗体组小鼠血清OVA特异性IgE的OD值分别为 (0.256±0.182) 和 (0.145±0.022)，两组间比较差异有统计学意义 (P＜0.01)(图 4)。抗CD1d单克隆抗体组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平明显低于哮喘组 (P＜0.01)，但明显高于对照组 (P＜0.01)(图 5)。
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图 4 各组血清中OVA特异性IgE水平比较 与哮喘组比较，**P＜0.01 |
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图 5 各组BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平比较 两组间比较，**P＜0.01 |
抗CD1d单克隆抗体组小鼠肺Ⅰ型NKT细胞数量明显低于哮喘组，但明显高于对照组 (P＜0.01)。以分泌细胞因子IL-4和IFN-γ作为Ⅰ型NKT细胞活化水平，抗CD1d单克隆抗体组小鼠肺IL-4+和IFN-γ+ Ⅰ型NKT细胞的百分数明显低于哮喘组，但明显高于对照组 (P＜0.01)(图 6、7，表 1)。
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图 6 各组肺Ⅰ型NKT细胞占肺单个核细胞 (MNCs) 的百分数比较 D门下的百分数表示肺Ⅰ型NKT细胞 (PBS-57/小鼠CD1d四聚体+ TCR-β+细胞) 占肺单个核细胞 (MNCs) 的百分数 |
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图 7 各组肺IL-4+和IFN-γ+ Ⅰ型NKT细胞占肺Ⅰ型NKT细胞百分数比较 横线上的百分数表示分泌IL-4(上图) 和IFN-γ(下图) 的Ⅰ型NKT细胞占肺Ⅰ型NKT细胞百分数 |
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表 1 流式细胞术检测肺MNCs中Ⅰ型NKT细胞数量和活性比较 (x±s) |
哮喘是由多种细胞和细胞成分参与的慢性炎症性疾病，慢性气道炎症、气道高反应和黏液分泌增加是其主要特征。经典观念认为CD4+Th2细胞是哮喘发病的重要环节，它通过产生Th2类细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等参与形成气道炎症和气道高反应[5]。目前认为除了Th2细胞，NKT细胞等也参与哮喘的形成[6]。NKT细胞表达CD1d限制性T细胞抗原受体 (T cell receptors，TCRs)，它识别的抗原不是MHC分子提呈的肽类抗原，而是由非经典的MHC样分子CD1d提呈的脂类抗原。根据TCRs特征，将NKT细胞分为Ⅰ型NKT细胞和Ⅱ型NKT细胞[2]。目前Ⅰ型NKT细胞在支气管哮喘发生中的作用备受关注。研究显示腹腔注射外源性糖脂类抗原α半乳糖神经酰胺 (α-GalCer) 可以通过活化Ⅰ型NKT细胞增强OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症；过继转移活化的Ⅰ型NKT细胞可以增强哮喘小鼠气道炎症，同时采用OVA致敏和激发缺乏Ⅰ型NKT细胞的CD1d-/-小鼠，发现小鼠Th2炎症反应明显减轻[7-9]。这些研究提示Ⅰ型NKT细胞可以增强哮喘小鼠气道炎症。研究显示通过诱导Ⅰ型NKT细胞分泌白细胞介素-4可以减轻小鼠自身免疫性脑脊髓炎的严重程度，且这种作用依赖CD1d分子[10]。因此干预Ⅰ型NKT细胞的免疫调节功能可能为哮喘提供新的治疗靶点。本研究通过建立BALB/c小鼠哮喘模型，结果发现OVA致敏和激发使小鼠肺组织炎性细胞浸润明显，杯状细胞明显增生，BALF中细胞总数及巨噬细胞、嗜酸粒细胞等数量明显增加，血清中OVA特异性IgE以及BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平明显增高；经尾静脉注射抗CD1d单克隆抗体可以减轻小鼠肺组织炎性细胞浸润及杯状细胞增生，降低BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞数量以及血清中OVA特异性IgE和BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平，结果提示尾静脉注射抗CD1d单克隆抗体可以减轻哮喘小鼠气道炎症。
目前认为Ⅰ型NKT细胞活化需要两个信号，TCR识别CD1d-脂质复合体构成的第一信号和抗原提呈细胞产生的细胞因子，如IL-12构成的第二信号[11]。Ⅰ型NKT细胞活化依赖CD1d分子递呈的内源性或者外源性脂类抗原[12]。我们研究发现抗CD1d单克隆抗体组小鼠肺Ⅰ型NKT细胞和IL-4+和IFN-γ+ Ⅰ型NKT细胞数量明显低于哮喘组，结果提示抗CD1d单克隆抗体可以降低Ⅰ型NKT细胞的活化水平。由于树突状细胞是最主要的抗原提呈细胞，是参与哮喘Th2免疫反应的重要环节。Abós-Gracia等研究发现橄榄树花粉可以通过上调树突状细胞表面CD1d的表达活化Ⅰ型NKT细胞，同时伴随DC表面CD86的升高[13]。因此我们推测抗CD1d单克隆抗体可能通过抑制树突状细胞抗原提呈功能降低Ⅰ型NKT细胞活性，进一步减轻哮喘小鼠的气道炎症，但仍需进一步研究。
综上所述，抗CD1d单克隆抗体可能通过抑制肺Ⅰ型NKT细胞活性减轻哮喘小鼠气道炎症，这可能成为哮喘治疗的新靶点。
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