武汉大学学报(医学版)   2016, Vol. 37Issue (2): 191-194,199   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.005.
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引用本文 

聂莉, 吴薇, 鲁志兵, 姚朝辉. CXCR3基因在小鼠急性肺损伤中的作用及与白细胞介素-10的关系[J]. 武汉大学学报(医学版), 2016, 37(2): 191-194,199. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.005.
NIE Li, WU Wei, LU Zhibing, YAO Zhaohui. Effect of CXCR3 on Acute Lung Injury Mice and Its Relationship to IL-10[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2016, 37(2): 191-194,199. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.02.005.

作者简介

聂莉，女，1980-，医学博士，主治医师，主要从事肺部急慢性炎症性疾病的临床与基础研究

基金项目

国家自然科学基金青年基金资助项目(编号：81200058)

文章历史

收稿日期：2015-03-12
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
CXCR3基因在小鼠急性肺损伤中的作用及与白细胞介素-10的关系
聂莉 1, 吴薇 2, 鲁志兵 3, 姚朝辉 1     
1. 武汉大学人民医院 老年病科 湖北 武汉 430060;
2. 武汉大学人民医院 检验科 湖北 武汉 430060;
3. 武汉大学人民医院 心内科 湖北 武汉 430060
收稿日期：2015-03-12
基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(编号：81200058)
作者简介：聂莉，女，1980-，医学博士，主治医师，主要从事肺部急慢性炎症性疾病的临床与基础研究
[摘要] 目的: 探讨CXCR3在内毒素脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺损伤(ALI)发病机制中的作用及与白细胞介素-10(IL-10)的关系。 方法: 将24只雄性C57BL/6小鼠分为正常组、LPS 2 h组及LPS 12 h组。HE染色观察肺组织病理改变；流式细胞术检测肺泡灌洗液(BALF)和肺组织CD8+T细胞及CD4+T细胞百分比；酶联免疫吸附试验及实时荧光定量PCR分别检测BALF和肺组织中IL-10和CXCR3的表达。 结果: LPS 12 h组BALF和肺组织炎症细胞数及CXCR3的表达均较正常组及LPS 2 h组增多(P＜0.05)；IL-10的表达较正常组及LPS 2 h组降低(P＜0.05)，且与CXCR3的表达及CD8+T细胞数呈负相关(P均 < 0.05)。 结论: CXCR3可参与急性肺损伤炎症的发生与发展，且与IL-10的表达呈负相关。重建CXCR3及IL-10的平衡可能会成为治疗ALI的新目标。
关键词： 急性肺损伤    CXCR3    CD8+T细胞    白细胞介素-10    
Effect of CXCR3 on Acute Lung Injury Mice and Its Relationship to IL-10
NIE Li1, WU Wei2, LU Zhibing3, YAO Zhaohui1     
1. Dept. of Geriatrics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;
2. Dept. of Clinical libratory, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;
3. Dept. of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
[Abstract] Objective: To investigate the roles of CXCR3 in the pathogenesis of acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS) and its relationship to Interleukin 10 (IL-10). Methods: Twenty-four healthy male C57BL/6 mice were divided into control group, LPS 2 h group and LPS 12 h group. The lung histopathology changes were observed by HE staining. The percentage of CD4+T cells and CD8+T cells in bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and lungs were examined by FCM. Expression of IL-10 and CXCR3 in BALF and lung tissue were detected by ELISA and real-time quantitative PCR. Results: Compared with the LPS 2 h group and normal group mice, LPS 12 h group mice showed higher LPS-induced lung inflammation as evidenced by more infiltration of inflammatory cells in airways and lung tissue, higher levels of CXCR3, and lower levels of IL-10(P <0.05). The level of CXCR3 showed a negative correlation with the level of IL-10, and the percentage of CD8+T cells from BALF and lungs negatively correlated with the level of IL-10. Conclusion: The findings show that CXCR3 participate in the occurrence and development of ALI, and correlates positively to the level of IL-10. Rebuilding the balance between CXCR3 and IL-10 may be a novel therapeutic target for ALI treatment.
Key words: Acute Lung Injury    CXCR3    CD8+T cells    Interleukin-10    

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床常见的危重症，病死率居高不下，认识其发病机制是寻找有效治疗措施，改善预后的关键。多种炎症细胞、炎症介质参与其发生发展，炎症介质/抗炎症介质失衡是目前的研究热点。新近的研究显示CXC趋化因子受体3(CXCR3)可通过募集CD8+T细胞及促进干扰素-γ(IFN-γ)和IFN-γ诱导蛋白-10(IFN-γ induced protein-10，IP-10/CXCL10)等细胞因子的释放而启动炎症级联反应。而白细胞介素-10(Interleukin 10，IL-10)是一种重要的抗炎因子，对CD8+T细胞有抑制作用，可减轻ALI的炎症反应。本实验探讨CXCR3在LPS所致小鼠ALI发病机制中的作用及与IL-10的关系，为该病的防治提供理论依据和新的方法。

1 材料与方法 1.1 实验动物

24只健康10-12周龄雄性C57BL/6小鼠，体重20-22 g/只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：HNASLKJ20122321。

1.2 主要仪器与试剂

内毒素脂多糖(LPS)、牛血清白蛋白(BSA)、藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、RPMI-1640培养液、胎牛血清(FBS)、青链霉素双抗、胶原酶、ELISA试剂盒(美国Sigma公司)，磷酸缓冲盐(PBS)、乌拉坦(北京化工厂)，Trizol Reagent (美国Invitrogen公司)，EPICS XL型流式细胞仪(美国COULTER公司)，实时荧光定量PCR仪(美国Illumina公司)，cytospin2Ⅱ型细胞离心涂片机(英国SHANDON公司)。

1.3 方法 1.3.1 动物分组及造模

将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、LPS 2 h组及LPS 12 h组，每组8只。LPS 2 h组及LPS 12 h组通过尾静脉注射LPS (10 mg/kg)制作ALI模型，并分别于造模后2 h和12 h获取标本。

1.3.2 标本采集

用12%乌拉坦(0.15 ml/10 g)腹腔注射过量麻醉处死并固定小鼠。动静脉留置针进行气管插管，用PBS灌洗肺组织并获取肺泡细胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)。细胞计数板计数细胞总数，行流式细胞检测及ELISA测定。肺组织分别行流式细胞检测、荧光定量PCR检测及HE染色。

1.3.3 CD8+T细胞和CD4+T细胞表达的流式细胞分析

将BALF离心后弃上清，加入流式细胞封闭液(BSA +PBS配制)重悬浮细胞层。以PE标记的CD4+和FITC标记的CD8+ T细胞，在流式细胞仪上分析T细胞亚群。肺组织在流式细胞工作液(RPMI1640+FBS+青链霉素双抗+胶原酶+DNAase配制)中剪碎，离心后弃上清，加入流式细胞封闭液重悬浮细胞层。加入PE标记的CD4+T细胞和FITC标记的CD8+T细胞，上机检测。

1.3.4 BALF细胞分类计数

将BALF离心后用PBS重悬浮细胞，并进行点片，空气干燥后用95%乙醇固定15 min，行HE染色。显微镜下进行细胞分类计数。

1.3.5 ELISA检测BALF中炎症因子的表达

取BALF上清液检测IL-10和CXCR3的表达。实验步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3.6 实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织中CXCR3和IL-10 mRNA的表达

引物探针由武汉金斯瑞生物科技有限公司设计和合成。各引物序列详见表 1。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并逆转录为cDNA。在PCR上以cDNA为模板扩增CXCR3、IL-10和β-actin，将回收产物作为标准品，计算出拷贝数并行荧光定量PCR，根据每个标准品达到阈值时的循环数(Ct值)绘制标准曲线，再由标准曲线和样品的Ct值计算出样本的初始拷贝数。

表 1 PCR扩增引物序列
1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，数据以x±s表示。计量资料分别以t检验及方差分析评价其差异的显著性，相关性分析采用Pearson相关系数。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 肺组织HE染色结果

正常组小鼠气道上皮结构完整，肺泡结构正常。肺泡内未见炎性细胞浸润，肺泡间隔无明显水肿。LPS 2 h及12 h组气道黏膜上皮细胞部分脱落，部分气道壁有炎症细胞浸润，部分肺泡间隔增宽。且LPS 12 h组气道壁炎症细胞浸润及肺泡间隔增宽程度更重(图 1)。

图 1 各组小鼠肺组织病理学改变(HE×400) A.正常组; B. LPS 2 h组; C. LPS 12 h组
2.2 BALF中细胞分类的变化

LPS 12 h组BALF白细胞总数、淋巴细胞数、中性粒细胞数及巨噬细胞数均较LPS 2 h组和正常组明显增高(P＜0.05)。LPS 2 h组BALF白细胞总数及中性粒细胞数较正常组明显增高，具有统计学意义(P＜0.05)(表 2)。

表 2 各组小鼠BALF细胞分类的变化(x±s)
2.3 BALF和肺组织中CD8+T细胞和CD4+T细胞的变化

LPS 12 h组小鼠BALF与肺组织中CD8+T细胞的百分比均较正常组及LPS 2 h组显著升高(P＜0.05)。LPS 2 h组小鼠BALF与肺组织中CD8+T细胞数较正常组明显升高(P＜0.05)。LPS 12 h组小鼠BALF与肺组织中CD4+T细胞百分比明显低于正常组及LPS 2 h组(P＜0.05)，而正常组与LPS 2 h组CD4+T细胞差异无统计学意义(P>0.05，表 3、表 4)。

表 3 各组小鼠BALF中T细胞亚群检测结果的比较(x±s)
表 4 各组小鼠肺组织中T细胞亚群检测结果的比较(x±s)
2.4 小鼠BALF中炎症因子的表达情况

LPS 12 h组小鼠BALF中CXCR3的表达显著高于正常组和LPS 2 h组(P＜0.05)，且LPS 2 h组高于正常组(P＜0.05)。正常组与LPS 2 h组BALF中IL-10的表达均较LPS 12 h组明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)，且正常组高于LPS 2 h组(P＜0.05，表 5)。

表 5 各组小鼠BALF中炎症因子表达情况(x±s)
2.5 各组小鼠肺组织中炎症因子mRNA的表达

LPS 12 h组小鼠肺组织中CXCR3 mRNA的表达显著高于正常组和LPS 2 h组(P＜0.05)，LPS 2 h组CXCR3 mRNA的表达高于正常组(P＜0.05)。正常组与LPS 2 h组小鼠肺组织中IL-10 mRNA的表达均较LPS 12 h组明显升高，具有统计学意义(P＜0.05)，且正常组高于LPS 2 h组(P＜0.05，表 6)。

表 6 各组小鼠肺组织中炎症因子mRNA表达情况(x±s)
2.6 CXCR3及CD8+T细胞与IL-10的相关性

小鼠BALF及肺组织中CXCR3的表达均与IL-10呈负相关，相关系数r分别为-0.969、-0.664(P＜0.05)。小鼠BALF及肺组织中CD8+T细胞数与IL-10的表达亦呈负相关，相关系数r分别为-0.965、-0.612(P＜0.05)。

3 讨论

ALI是指由严重感染、休克、创伤及烧伤等心源性以外的各种因素导致的肺实质损伤，是常见的危重症，认识其发病机制是寻找有效治疗措施，改善预后的关键。研究认为，ALI时中性粒细胞、淋巴细胞等多种炎症细胞在肺内聚集以及血管内皮细胞的功能受损，释放多种炎症介质、氧自由基、蛋白酶，炎症介质/抗炎症介质失衡机制在其发生发展过程中起重要作用[1]。因此，阻断炎症介质和细胞因子的释放，重建炎症介质/抗炎症介质平衡成为治疗ALI的研究热点。

IL-10主要由T细胞、巨噬细胞和活化的B细胞产生，对CD8+T细胞有抑制作用，是一种重要的抗炎细胞因子和免疫抑制剂，可抑制单核细胞分泌多种细胞因子，减少前炎症介质和细胞因子的释放，发挥抗炎作用[2, 3]。我们推测，IL-10的激活可能下调ALI炎症反应。趋化因子是重要的细胞因子，与趋化因子结合后，可募集炎症细胞，释放细胞因子，从而在机体炎症中发挥作用[4]。研究显示，CXCR3可由炎症细胞、气道上皮细胞、内皮细胞等释放，主要表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞和肺泡巨噬细胞等表面，在炎症反应中起重要作用[5]。研究发现[6]，CXCL10通过与CXCR3结合而趋化炎症细胞，参与肺部炎症的发展和损伤。CXCR3是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的重要炎症介质，可能是通过调节细胞免疫反应和炎性细胞因子的产生，从而介导COPD肺部炎症反应过程，并与气流受限程度呈负相关[7]。COPD患者的肺内淋巴细胞分泌更多的IFN-γ、CXCL9以及CXCL10，其中IFN-γ由Th1细胞释放，而CXCL9和CXCL10与CXCR3结合，可吸引Th1细胞并诱导肺内巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶-12(MMP-12)增加，导致肺组织的破坏和肺气肿的产生[8]。我们的前期实验亦显示，CD8+T细胞募集可使IFN-γ分泌增加，从而诱导CXCR3释放，进而促进吸烟导致的ALI的炎症反应[9, 10]。

LPS是脂质和多糖的复合物，为革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，是内毒素的特异性抗原(O抗原)。LPS不仅可通过刺激中性粒细胞、内皮细胞等炎症细胞产生炎症介质和细胞因子，还可损伤肺泡毛细血管膜，使之通透性升高，从而诱发ALI。我们的实验显示，LPS 12 h组小鼠BALF中多种炎症细胞较正常组及LPS 2 h组增多。结合HE染色结果，表明我们成功制备LPS致小鼠ALI模型，并且随着LPS作用时间的延长，炎症程度加重。ALI时CD8+T细胞募集增加，CXCR3的表达增加，且LPS 12 h组BALF及肺组织中CXCR3的释放较正常组及LPS 2 h组增多。IL-10亦参与LPS所致小鼠ALI的炎症反应过程，且IL-10与CXCR3的变化呈负相关。我们采用流式细胞术测定对照组小鼠和不同时间点ALI小鼠BALF和肺组织CD8+T细胞的百分比，结果显示CD8+ T细胞的变化与IL-10呈负相关，故可推测，IL-10的释放增加后，CD8+ T细胞募集可减少，下调CXCR3的表达，炎症反应从而减弱。这也为进一步的实验提供了方向。

以上实验显示，CXCR3及IL-10分别是ALI重要的炎症介质及抗炎症介质，两者的表达呈负相关。重建CXCR3及IL-10的平衡可能会为ALI的治疗提供新的靶点。

参考文献
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