8周龄CYP1B1基因敲除(KO)小鼠(美国Frank Gonzalez博士赠送)3只，17-19 g；8周龄SPF级C57BL/6J野生型(WT)小鼠3只，17-19 g，分别作为骨髓移值小鼠的供体，提供CYP1B1基因敲除骨髓和野生型骨髓。10周龄SPF级C57BL/6J野生型(WT)小鼠20只，22-24 g[湖北省疾病预防控制中心提供，动物合格证号为42000600002003，动物房合格证号为SCXX (鄂)2008-0005]，作为骨髓移植的受体进行辐射，随机分为WT组和KO组，每组10只。所有小鼠均按组别以每笼5只分笼喂养，自由饮水摄食。动物房控制温度(24±2)℃，相对湿度(45±15)%。

断颈处死8周龄CYP1B1基因敲除小鼠及WT小鼠各3只，无菌条件下收集两组小鼠股骨及小腿骨。分离周围组织，将股骨两端软骨剪去，露出红色的骨髓腔。用1 ml无菌注射器吸取含2%胎牛血清的RPMI 1640液，轻轻插入骨髓腔冲出骨髓腔内的骨髓，吹打混匀后，用40目滤网过滤，用无血清RPMI 1640洗涤2次，计数调整细胞浓度为3.0×10⁶/L备用。在放射线照射前5 d至移植后的4周内，受体小鼠均饮用加有新霉素(100 mg/L)和多黏菌素B (10 mg/L)的灭菌酸性蒸馏水(pH 2.6)^[5]。采用⁶⁰Co全身照射，总剂量8.25 Gy、0.33 Gy/min，共25 min。将20只10周龄雄性小鼠，照射后3 h内经尾静脉按照每只小鼠7.5×10⁵个细胞分别输注CYP1B1基因敲除及WT组小鼠骨髓细胞。骨髓移植的成功以受体小鼠出现WT小鼠不具有而CYP1B1敲除所插入的NEO基因作为依据。

EDTA抗凝管收集小鼠血液，3 000 r/min、10 min离心处理后，分离出有核细胞层。按照血液DNA提取试剂盒说明操作，提取血液中的基因组DNA，测DNA浓度后，-20 ℃保存备用。采用Primer 5.0软件设计后并在数据库中验证，最后有武汉擎科生物创新生物科技有限公司合成。

小鼠NEO基因序列引物(460 bp)设计:

上游:5′-TGAATGAACTGCAGGACGAG-3′；

下游:5′-CCACAGTCGATGAATCCAGA-3′；

小鼠CYP1B1基因序列引物(365 bp)设计:

上游:5′-CTGAGTTGGACCAGGTTGTGG-3′；

下游:5′-CATGGATTCTAAACGACTAGG-3′。

在0.5 ml的EP管中加入双蒸水(ddH₂O)，上、下游引物，2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸(deoxynucleosine triphosphate, dNTP)，10倍稀释的缓冲液，DNA和Taq酶，总体积为20 μl。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)条件:95 ℃预变性15 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，38个循环。用2.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物特异性进行检验。血液DNA提取试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。

参见文献[6]。

实验数据均以x±s进行表示。用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用t检验分析体重增长率和GVHD评分，以P＜0.05为差异有统计学意义。

骨髓移植后取受体小鼠的血液样本提取DNA，用PCR实验检测到NEO基因，说明供体小鼠骨髓移植到受体小鼠体内后骨髓重建成功。我们同时也检测到KO组中血液DNA仍然有CYP1B1的表达，但明显少于WT组，说明8.25 Gy ⁶⁰Co的照射剂量下受体小鼠仍然会有部分骨髓残留(图 1)，我们重建的CYP1B1敲除骨髓移植模型可能会受到残留骨髓的影响，只能发挥部分的功能。

图 1(Figure 1)

图 1 骨髓移植受体小鼠骨髓重建CYP1B1基因和NEO基因检测结果

受体鼠采用总剂量8.25 Gy的⁶⁰Co放射线全身照射后，3 h内经尾静脉输注CYP1B1基因敲除和WT骨髓细胞，4周后WT组小鼠存活率为50%(n=5)，KO组小鼠存活率为70%(n=7)。由图 2生存分析可知，KO组小鼠骨髓移植后平均生存时间为(26.10±2.34) d，优于WT组骨髓移植平均生存时间(18.70±1.62) d，KO组小鼠生存时间延长，P＜0.05；由于死亡小鼠的体重降幅显著，我们在做两组小鼠体重分析时，剔除了死亡小鼠的体重数据(图 3)。骨髓移植后，KO组与WT组小鼠均于移植后7 d内开始出现体重下降，表现出对辐射的反应，KO组小鼠7 d后恢复初始体重，之后表现持续增长的趋势，而WT组小鼠体重波动大，22 d左右才恢复至初始体重，且KO组小鼠体重增长率始终高于WT组小鼠，P＜0.05，见表 1。提示CYP1B1敲除在骨髓移植小鼠生存时间和体重恢复上有一定的保护作用。

图 2(Figure 2)

图 2 骨髓移植后两组小鼠生存情况比较

图 3(Figure 3)

图 3 两组小鼠骨髓移植后体重增加率比较情况 与WT组比较，*P＜0.05

表 1(Table 1)

表 1 骨髓移植前及4周后两组小鼠体重的变化   重量变化 WT (n=5) KO (n=7)   辐射前(g) 24.08±0.31 23.48±0.49   辐射后(g) 26.28±0.27 26.01±0.56   体重增量(g) 2.2±0.17 2.53±0.03*   与WT组比较，*P＜0.05

表 1 骨髓移植前及4周后两组小鼠体重的变化

图 4为骨髓移植小鼠典型的GVHD症状，小鼠表现出怠倦、少动、毛发紊乱、竖毛、弓背、肛门红肿、腹泻等症状。根据Cooke^[6]的GVHD临床表现评分细则，定期对两组小鼠进行GVHD临床评分(如图 5)，13 d后开始两组小鼠出现程度不一的GVHD表现。GVHD评分WT组始终高于KO组，13 d评分KO组(0.44±0.57)低于WT组(2.0±0.00)，P＜0.05，15 d评分KO组(0.44±0.39)低于WT组(2.50±0.30)，P＜0.05，16 d评分KO组(2.5±0.29)低于WT组(4.0±0.00)，P＜0.05，18 d评分KO组(3.0±0.00)低于WT组(5.0±0.60)，P＜0.05，20 d评分KO组(3.5±0.29)低于WT组(5.5±0.71)，P＜0.05。且KO组小鼠4周内GVHD反应有显著减轻的趋势，WT小鼠的GVHD反应4周内依然呈现加剧趋势，提示KO鼠呈现GVHD时间短、反应轻的现象。

图 4(Figure 4)

图 4 出现GVHD症状的小鼠照片 A:小鼠表现嗜睡、少动；B:小鼠表现皮毛紊乱、竖毛；C:小鼠表现弓背；D:小鼠表现肛门红肿、腹泻

图 5(Figure 5)

图 5 两组小鼠骨髓移植后GVHD评分对比 与WT组比较，*P＜0.05

异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)是目前可以治愈恶性血液肿瘤的有效手段，它通过输注正常供者的造血干细胞到患者体内，重建患者的造血和免疫功能。而移植物抗宿主病(GVHD)是allo-HSCT后的主要并发症及死亡原因，如何防治GVHD随之成为all-HSCT的热点问题之一。本实验室前期的研究结果显示，CYP1B1对小鼠的脂肪形成及胰岛素抵抗具有显著影响，并且我们在巨噬细胞功能实验中，也验证了CYP1B1敲除对巨噬细胞的迁移能力及吞噬功能是有显著影响的。基于此结论上，我们在动物实验中重建骨髓移植CYP1B1敲除小鼠模型并大胆假设，CYP1B1在骨髓巨噬细胞的异基因移植中具有一定的作用。在建立KO小鼠异基因骨髓移植模型的过程中，我们观察两组小鼠生存情况和GVHD表现的区别，来观察CYP1B1在这其中所起到的作用。本实验根据相关文献及本实验室前期经验，给予受体WT小鼠总剂量8.25 Gy ⁶⁰Co辐照后，回输供鼠CYP1B1基因敲除和WT骨髓细胞以重建KO和WT小鼠，KO组小鼠体重恢复情况显著优于WT组小鼠，并且波动情况较WT组比较轻。我们重点观察了Cooke^[6]等的移植动物GVHD的临床标准，同时也对皮下、肝脏、肠找到出血点证实小鼠GVHD的发生。在两组小鼠GVHD评分中可以看到，KO组小鼠的GVHD评分较WT组小鼠相比较低，表现出GVHD时间短、反应轻的现象。在生存时间上，KO表现出显著性的延长趋势。提示CYP1B1敲除在在小鼠骨髓移植中有延长小鼠平均生存时间、增加小鼠体重、改善GVHD的作用。由于国内对于此相关研究甚少，并且均不深入，后续为了验证我们的结果是否具有偶然性，我们在雄鼠模型中重复了3次，雌鼠模型中重复了2次，存活率均呈现出KO组小鼠高于WT组，生存情况也较WT组有明显改善。

综上，我们认为CYP1B1敲除在小鼠骨髓移植中有延长平均生存时间、增加小鼠体重、改善GVHD的作用，但关于CYP1B1敲除发挥此作用的时效性以及其机制仍待我们下一步的深入研究。