心肌缺氧缺血损伤是心肌梗死或心脏手术中不可避免的损伤因素，涉及多种分子机制及信号通路，其中，高迁移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB1) 被发现与心肌缺氧损伤密切相关^[1]。HMGB1是一种染色体结合蛋白，已被证实参与维持核小体的稳定，基因的传递，细胞分化、炎症反应、免疫等多种生理病理过程^[2]。HMGB1可由坏死细胞被动释放至胞外，也可由免疫细胞主动分泌放至胞外，引起相应的病理反应^[3]。

一氧化碳(carbon monoxide，CO)常被认为是一种有毒气体，它极易与体内血红蛋白结合形成碳氧血红蛋白，导致机体缺氧。事实上，CO也是人体内正常的气体信使。它是由体内血红素加氧酶催化血红素而生成，在生理状况下承担着重要作用，被称为内源性CO，近10年研究表明，促进内源性CO生成或给予外源性CO在多个损伤模型中都具有抗凋亡、抗炎、抗氧化等保护作用^[4]，而一定量的CO同样已被证实能减少心脏缺氧缺血损伤^[5]。研究证明CO可能通过多种分子机制减少细胞缺氧损伤，包括诱导趋化因子CXCL12表达，抑制线粒体膜的通透性等^{[6, 7]}，但具体机制尚未完全阐明。由此，本研究通过一氧化碳释放分子2(carbon monoxide-releasing molecule 2, CORM-2) 缓慢释放CO，拟在心肌细胞缺氧模型的水平上，探讨CORM-2对缺氧心肌细胞内HMGB1分布和表达变化影响以及对心肌细胞的保护作用，以期为CO的临床运用提供一定的理论依据。

H9C2心肌细胞株(中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心)；CORM-2(美国Sigma-Aldrich公司)，DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)；DMEM无糖培养基(美国Gibco公司), 胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；细胞核浆分离试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(美国eBioscience公司)；抗HMGB1抗体(美国Abcam公司)；抗Caspase-3抗体(美国Cell Signaling Technologies公司)；抗β-actin抗体(美国Genetex公司)、CCK-8试剂盒(日本DOJINDO公司)，其余试剂均为分析纯。

大鼠H9C2心肌细胞常规接种在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM高糖培养液中，置于37 ℃，5%CO₂孵箱内培养。每48 h换液1次，当培养瓶中的细胞密度达80%-90%时，用0.25%胰酶消化接种于96孔板、6孔板或60 mm培养皿中。当每孔细胞密度达80%-90%时，可进入实验。选取生长密度相似，生长状况良好的对数期心肌细胞进行随机分组：① 正常组(H9C2)：未经缺氧处理，置于37 ℃，5%CO₂孵箱内培养；② 缺氧组(Hypoxia+H9C2)：将常规培养基置换为无糖无血清DMEM培养基，置于缺氧培养箱行缺氧处理；③ CORM-2组(CORM-2+ Hypoxia+H9C2)：CORM-2即配即用，使用时溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配成浓度为0.1 μmol/L溶液，在实验前1 h加入培养基后放入5%CO₂孵箱内行预处理，1 h后置换无糖无血清DEME培养基行缺氧处理；④ ICORM-2组(ICORM-2+Hypoxia+ H9C2)：失活CO释放分子2(iCORM-2) 为CORM-2溶于二甲基亚砜(DMSO)室温放置24 h待CO分解释放完全后制成，溶液浓度为0.1 μmol/L，在实验前1 h加入培养基后放入5%CO₂孵箱内行预处理，1 h后置换无糖无血清DMEM培养基行缺氧处理。

将无糖无血清DMEM培养基在缺氧培养箱(37 ℃，94% N₂, 5% CO₂、1%O₂)平衡4 h，将平衡后的无糖无血清培养基置换培养皿内的常规培养基，CORM-2组及ICROM-2组分别加入相应浓度的CORM-2和iCORM-2溶液，预处理1 h后均放入缺氧培养箱进行缺氧处理12 h。正常组在含血清的DMEM高糖培养基，37 ℃、5% CO₂的孵箱内培养12 h。

将H9C2细胞接种于96孔板，每组设置5个副孔，按上述实验方法进行实验后，每孔加10 μl CCK-8试剂，轻摇，37 ℃孵育2 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(OD)。去除最大值与最小值，取4孔OD值的平均数，按公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(处理组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%，重复3次。

根据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒所提供的方法，行流式细胞检测。

H9C2细胞经实验处理后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.25% Triton破膜处理10 min，5% BSA封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜, 第2天二抗孵育2 h, DAPI染核8 min, 封片。在荧光显微镜下观察HMGB1的荧光表达, 取10个视野。

Blot法检测胞浆胞核HMGB1及凋亡相关蛋白的表达情况① 总蛋白样本提取：使用常规蛋白提取方法提取总蛋白；② 胞浆胞核蛋白提取：根据核浆蛋白分离试剂盒说明书分别提取细胞浆蛋白；③ 采用BCA法测定蛋白含量并制作标准曲线，按常规Western Blot法完成操作，采用美国LICOR公司Odyssey双色红外激光成像系统扫描，Odyssey软件测定灰度值并进行分析, 相同实验重复3次。

采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(x±s)表示，实验数据除荧光形态图为定性资料外，均为定量资料，两组间比较采用t检验，校验水准α= 0.05；多组间比较，数据符合正态分布，方差齐性检验符合方差整齐的假设，行单因素方差分析及LSD检验，P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

分别应用不同浓度CORM-2溶液预处理H9C2心肌细胞1 h后行缺氧处理12 h，缺氧细胞活力[(34.7±4.9)%]较正常组[(100±5.9)%]明显减低(P＜0.05)，60 μmol/L CORM-2较缺氧组提高细胞活性(P＜0.05)(表 1)，所以接下来的实验过程中CORM-2浓度均为60 μmol/L。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度CORM-2预处理对缺氧H9C2细胞活性影响(x±s) 组别 细胞存活率(%) 正常组 100.0±5.9 缺氧组 34.7±4.9# 20 μmol/L CORM-2 36.5±4.8# 40 μmol/L CORM-2 42.7±4.9# 60 μmol/L CORM-2 51.4±5.0# * 80 μmol/L CORM-2 33.6±6.4# 100 μmol/L CORM-2 31.0±4.7#  与正常组比较，#P＜0.5；与缺氧组比较，*P＜0.05

表 1 不同浓度CORM-2预处理对缺氧H9C2细胞活性影响(x±s)

正常细胞中HMGB1大部分在细胞核中，而H9C2经12 h缺氧后，HMGB1部分迁移释放至细胞浆，CORM-2预处理的细胞可减少HMGB1的迁移释放，ICORM-2组HMGB1细胞浆释放量与缺氧组未见明显变化(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 HMGB1核浆分布情况(×200)

H9C2经过12 h缺氧后，细胞凋亡率明显上升。而使用CORM-2预处理的细胞能明显减少凋亡，使细胞凋亡率从(27.4 ±4.2)%降低到(14.1±1.9)%(P＜0.05)，使用ICORM-2预处理的细胞并不能明显减少细胞凋亡(图 2，表 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 CORM-2预处理对胞浆HMGB1的影响 A：正常组；B：CORM-2组；C：ICORM-2组；D：缺氧组与正常组比较，#P＜0.05；与缺氧组比较，*P＜0.05

表 2(Table 2)

表 2 CORM-2预处理对缺氧细胞凋亡的影响(x±s) 组别 细胞活性(%) 正常组 9.6±1.2 CORM-2组 14.1±2.8* ICORM-2组 27.4±2.7# 缺氧组 29.4±4.2#  与正常组比较, #P＜0.05;与缺氧组比较, *P＜0.05

表 2 CORM-2预处理对缺氧细胞凋亡的影响(x±s)

Western Blot检测H9C2 HMGB1细胞浆迁移释放情况，结果表明，与正常对照组比较，HMGB1在缺氧心肌细胞胞浆内迁移释放明显增多(P＜0.05)，使用CORM-2预处理后则明显减少(P＜0.05)。Western Blot同时检测H9C2总蛋白内的HMGB1及Cleaved Caspase-3表达水平，发现HMGB1及Cleaved Caspase-3表达在缺氧组明显升高，而CORM-2组蛋白表达较缺氧组降低(P＜0.05)。ICORM-2组与缺氧组在胞浆HMGB1迁移释放及总HMGB1和Cleaved Caspase-3表达上无明显差异。

图 3(Figure 3)

图 3 CORM-2预处理对细胞HMGB1及Cleaved caspase-3影响 A：正常组；B：CORM-2组; C：ICORM-2组；D：缺氧组 Cleaved caspase-3:与正常比较，#P＜0.05, 与缺氧组比较，*P＜0.05 HMGB1:与正常组比较，▲P＜0.05, 与缺氧组比较，△P＜0.05

心肌缺氧损伤是心肌梗塞及心脏手术过程中不可避免的损伤，而HMGB1与心肌缺氧损伤密切相关，损伤心肌能释放HMGB1，释放后的HMGB1与其相关受体结合：① 与晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)结合，激活细胞核表面的NF-κB信号转录因子活化细胞，促进IL-6及TNF-α等炎症因子的释放；② 与Toll样受体(Toll-1ike receptors，TLRs)结合，通过MyD88通路或Toll白细胞介素受体相关调节因子通路(非MyD88通路)，最终通过激活NF-κB通路及p38信号通路介导炎症反应或引起干扰素β及干扰素诱导基因的生成^{[3, 8, 9]}。

在离体心脏的研究表明，心脏在CO处理后提高了缺氧耐受性，能够增加基础冠状动脉血流和减轻冠脉痉挛程度，改善心脏收缩，减少室性心律失常的发生率^[10]。使用CORM-2预处理的离体心脏经缺血再灌注处理，结果提示缺血后心肌损伤标志物肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平显著降低。此外，CORM-2处理显著提高冠脉流量参数，减少梗死面积^{[11, 12]}。

本实验以HMGB1为切入点，研究CORM-2预处理对心肌细胞缺氧后HMGB1表达的影响，结果发现，CORM-2组心肌细胞活性明显提高，凋亡减少，Western Blot检测也发现HMGB1总含量及细胞浆分布量减少，相关凋亡指标也较缺氧组减低，这说明CORM-2能够明显减轻细胞损伤，而这极有可能是通过影响HMGB1分布和表达引起的。而ICORM-2组结果与缺氧组结果无明显差异。

综上所述，CORM-2能够影响缺氧心肌细胞内HMGB1的分布及释放，减小细胞凋亡，期望在将来的研究过程中，能在细胞及动物模型上进一步研究HMGB1所介导的信号通路, 以期更好地理解HMGB1在心肌细胞缺氧过程中所发挥的作用｡