肺癌是中国最常见的癌症，也是致死率高的一种恶性肿瘤^[1]。近年来我国肺癌的发病率和死亡率增长迅速，目前已居癌症相关死亡的首位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要类型，占肺癌的80%-85%。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是非小细胞肺癌的驱动基因之一，也是靶向治疗中的一个重要靶点^[2]。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，在许多肿瘤中过表达和(或)发生突变，主要是通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切关系。吉非替尼和厄罗替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI)在化疗耐药的非小细胞肺癌中取得了良好的效果，并且与EGFR基因的突变状态密切相关^[3]。

近年来，高通量测序技术以其高灵敏度高特异性等优点，在生命科学研究中得到广泛的应用，在基因突变的检测方面具有高效准确的优势，本研究通过高通量基因测序技术检测164例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况，分析深圳市肺癌患者EGFR的突变情况。

收集深圳市多个医院在2015年1月-2016年6月胸外科手术切除并经病理确诊的NSCLC患者送检组织标本164例，所有患者术前均未接受过放化疗和EGFR-TKI等抗肿瘤治疗。其中男性90例，女性74例，年龄为35-83岁，平均年龄约62岁。其中腺癌135例，非腺癌29例。吸烟者102例，不吸烟者62例(见表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 EGFR基因突变与临床特征的关系 项目 n 突变例数 阳性率(%) χ2 P 性别 7.37 0.006   男 90 24 26.67   女 74 36 48.65 年龄(岁) 0.366 0.545   >60 83 28 33.73   ≤60 81 32 39.51 吸烟史 27.975 < 0.05   有 102 21 20.59   无 62 39 62.90 病理类型 4.71 0.030   腺癌 135 55 40.74   非腺癌 29 5 17.24

表 1 EGFR基因突变与临床特征的关系

使用Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue KIT试剂盒提取肺癌组织中基因组DNA，操作步骤按试剂盒说明书，提取后测OD_260/280后放置于-20 ℃冰箱备用。

PCR扩增EGFR基因18、19、20、21号外显子，完成后回收DNA片段(扩增时分别设置阴性对照、阳性对照和空白对照)。反应体系：2× PCR Mix(HYK)25 μl, DNA模板(150 ng/μl) 1 μl, 正向引物(10 μmol/L) 1 μl, 反向引物(10 μmol/L)1 μl, ddH₂O加至50 μl。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 2 min；10 ℃保存；产物回收：PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(180 V，20 min)，切胶，使用华因康琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，20 μl dd H₂O洗脱，测浓度备用。

使用华因康短标签文库试剂盒(华因康，KL001)进行文库构建，操作步骤按试剂盒说明书。EPCR扩增DNA文库：使用华因康Emulsion PCR扩增试剂盒(华因康，KE001)进行文库扩增，操作步骤按试剂盒说明书。

使用Pstar-ⅡA高通基因测序仪进行基因测序。

采用软件Pstar-Ⅱ 6.0.4 build3进行分析。

采用SPSS 16.0软件进行χ²检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

164例非小细胞肺癌患者中，女性患者EGFR突变率为48.65%(36/74)，明显高于男性患者26.67%(24/90)(P＜0.05)。吸烟人群分析，非吸烟的非小细胞肺癌患者EGFR的突变率为62.9%(39/62)，显著高于吸烟者20.59%(21/102)(P＜0.05), 腺癌患者EGFR基因突变率为40.74% (55/135)，非腺癌患者突变率为17.24%(5/29)，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。EGRR基因突变与临床特征关系如表 1所示。

在164例肺癌标本中，检测到EGFR基因突变64例(39.02%，64/164)，其中外显子19突变(25例) del E746-A750型有14例(21.88%)，del L746-A751型有4例(6.25%)，del E746-R748突变类型1例(1.56%)，del L747-A750突变类型1例(1.56%)，del L747-T751突变类型4例(6.25%)(表 3)；外显子18突变2例，外显子20突变6例，外显子21突变31例，双突变5例。5例双突变中4例为20、21号外显子双突变，1例为19、21号外显子双突变(表 1)。在本组病例中，外显子21的突变(31例)类型均为L858R。

表 2(Table 2)

表 2 EGFR基因突变特点 突变基因 外显子 突变类型 n EGFR Exon18 点突变 2 EGFR Exon19 缺失突变 25 EGFR Exon20 插入/点突变 6 EGFR Exon21 点突变 31 EGFR Exon20&21 双突变 4 EGFR Exon19&21 双突变 1

表 2 EGFR基因突变特点

表 3(Table 3)

表 3 19号外显子突变特点 突变基因 外显子 碱基变化 氨基酸变化 n EGFR E19 del 2235-2244 E746-R748 del 1 EGFR E19 del 2235-2249 E746-A750 del 14 EGFR E19 del 2236-2250 E746-A751 del 4 EGFR E19 del 2237-2251 L747-A750 del 1 EGFR E19 del 2240-2251 L747-T751 del 2 EGFR E19 del 2240-2254 L747-T751 del 2 EGFR E19 del 2253-2276 S752-I759 del 1

表 3 19号外显子突变特点

据深圳市慢性病院防治中心的统计数据表明：近年来深圳市的新发癌症病例每年以10%-30%的比例增长，2013年全市新发恶性肿瘤报告病例14 774例，较2012年增加了2 644例，增长17.9%。而非小细胞肺癌在所有肿瘤中占据首位。因此了解非小细胞肺癌的基因突变类型对于肺癌的靶向治疗有着重要的意义。本研究表明，深圳市非小细胞肺癌的EGFR突变率为36.6%，是针对非小细胞肺癌靶向治疗的主要靶点。

目前，EGFR已成为非小细胞肺癌分子靶向治疗的重点和热点。EGFR基因位于7p12.1区，由28个外显子组成，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。大多数NSCLC表达EGFR及其天然配体。现有的一些药物通过阻断EGFR介导的信号传导, 从而抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞生命周期的延长、抑制肿瘤对周围组织的侵入、促进肿瘤细胞的凋亡^[4]。以吉非替尼和厄罗替尼^[5]为代表的EGFR-TKI靶向治疗在化疗耐药的非小细胞肺癌中取得了良好的效果，是现如今使用较多的非小细胞肺癌的药物之一^[3]。

在NSCLC的治疗过程中，以吉非替尼为代表的EGFR-TKI疗效较显著，大量研究结果显示，EGFR基因突变是决定EGFR-TKI疗效的最重要预测因子^[3]。关于EGFR基因突变的研究分析表明，尽管突变部位分散在整个酪氨酸激酶编码区，但绝大多数突变集中在19号外显子和21号外显子^[6]。EGFR不同位点的突变对EGFR-TKI疗效的影响不同，例如19号外显子的缺失突变和21号外显子的L858R突变，18号外显子的G719X点突变的NSCLC患者对EFGR-TKI治疗比较敏感。携带20号外显子的插入突变的患者可能对EGFR-TKI治疗产生耐药性，以及20号外显子的T790M突变是EGFR-TKI继发性耐药的重要机制之一。

有研究报道，美国等西方国家非小细胞肺癌患者中仅有约10%存在EGFR基因突变，然而在东方人中，约30%的非小细胞肺癌患者存在EGFR基因突变^[7-9]。本研究患者EGFR突变率为36.6%，与国内外文献报道相符。了解EGRF的突变情况对肺癌晚期患者的治疗有着重要的意义^[10]。本研究发现，EGFR突变在女性、不吸烟和腺癌患者中突变率较高，差异有统计学意义，这与其他学者的研究结果一致^[9]。而EGFR突变与年龄无关。

综上所述，NSCLC患者进行靶向治疗方案选择时可综合评估EGFR基因突变与临床病理指标，通过综合评估，为患者选择合适的靶向药物，提高药物有效率，降低毒副作用，减轻患者负担，提高患者的生存质量。