武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (2): 226-230   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.012.
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引用本文 

柴红, 王凤秀, 杨峥, 吴成云, 周成志, 陈明铠, 谭诗云, 王晓萍, 王高华, 罗和生. 抑郁引起大鼠结肠动力学改变导致肠易激综合征的L-型钙电流的变化[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(2): 226-230. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.012.
CHAI Hong, WANG Fengxiu, YANG Zheng, WU Chengyun, ZHOU Chengzhi, CHEN Mingkai, TAN Shiyun, WANG Xiaoping, WANG Gaohua, LUO Hesheng. Effect of Abnormal Colon Motility Induced by Depression on Irritable Bowel Syndrome via Altering L-Type Calcium Current in Rat Colonic Myocytes[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(2): 226-230. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.012.

作者简介

柴红, 女, 1973-, 医学硕士, 主要从事消化道疾病及肠道动力学改变的基础与临床研究

基金项目

国家自然科学基金资助项目(编号:30871248)

文章历史

收稿日期：2016-08-20
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
抑郁引起大鼠结肠动力学改变导致肠易激综合征的L-型钙电流的变化
柴红 1, 王凤秀 2, 杨峥 1, 吴成云 1,3, 周成志 1,3, 陈明铠 1, 谭诗云 1, 王晓萍 4, 王高华 4, 罗和生 1     
1. 武汉大学人民医院 消化内科 湖北 武汉 430060;
2. 北京信息职业技术学院医学门诊部 北京 100200;
3. 湖北省中医药大学附属医院内科 湖北 武汉 430061;
4. 武汉大学人民医院 精神科 湖北 武汉 430060
收稿日期：2016-08-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号:30871248)
作者简介：柴红, 女, 1973-, 医学硕士, 主要从事消化道疾病及肠道动力学改变的基础与临床研究
[摘要] 目的: 探讨抑郁引起大鼠结肠动力学改变导致肠易激综合征(IBS)后细胞膜上L-型钙电流(ICa-L)变化。 方法: SPF级成年雄性SD大鼠分为正常对照组(对照组, n=15)和抑郁症模型组(抑郁组, n=15)。抑郁模型制备方法是采用孤养加慢性温和不可预知性应激刺激方式进行, 28 d后通过旷场试验(OFT)和液体消耗试验(FCT)确定抑郁模型成功。根据临床表现、生成的粪便性状和数量确定IBS发生率。酶解法分离单个结肠平滑肌细胞, 全细胞膜片钳技术记录结肠平滑肌细胞膜上ICa-L及其电流-电压(I-V)曲线变化。 结果: 与对照组比较, 抑郁组大鼠出现体重增长减慢, OFT和FCT值显著降低(P均<0.01), 提示抑郁大鼠模型建立成功; 抑郁组大鼠出现严重体质减弱, 排便颗粒数及其含水量明显增高(P均<0.01), 与OFT和FCT值比较呈显著的负相关(r值均>-0.89, P均<0.01), 胃肠道症状的发生率显著增高(P<0.01), 说明抑郁引起大鼠出现严重的IBS病症。在电压钳制方式下, 与对照组比较, 抑郁组大鼠结肠平滑肌细胞膜上ICa-L峰值显著增大, 其I-V曲线明显下移到最底部和向左偏移。当钳制电位为+10 mV时, 抑郁组大鼠结肠平滑肌细胞ICa-L由对照组的(-21.31±4.79)pA增加为(-33.52±4.45)pA(P<0.01)。与抑郁大鼠的排便颗粒数及其含水量进行比较, 具有显著正相关(r均>0.91,P均<0.01)。 结论: 抑郁能引起大鼠胃肠道出现明显的IBS病症, 其发生机制可能是抑郁诱发了大鼠结肠平滑肌细胞膜上ICa-L增加出现电重构, 造成结肠性动作电位失常促使肠动力学改变形成。
关键词： 抑郁    结肠平滑肌细胞    离子通道重构    肠易激综合征    动作电位失常    
Effect of Abnormal Colon Motility Induced by Depression on Irritable Bowel Syndrome via Altering L-Type Calcium Current in Rat Colonic Myocytes
CHAI Hong1, WANG Fengxiu2, YANG Zheng1, WU Chengyun1,3, ZHOU Chengzhi1,3, CHEN Mingkai1, TAN Shiyun1, WANG Xiaoping4, WANG Gaohua4, LUO Hesheng1     
1. Dept. of Gastroenterology, Wuhan 430060 , China;
2. Medical Clinic, Beijing Information Technology College, Beijing 100200, China;
3. Dept. of Gastroenterology, Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430061 , China;
4. Dept. of psychiatry, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060 , China
[Abstract] Objective: To investigate alterations of L-type calcium current (ICa-L) after depression induced irritable bowel syndrome (IBS) from ion channel remodeling in rat colonic myocytes. Methods: The male Sprauge-Dawley rats were divided into normal control (control group, n=15) and depression model (depression group, n=15). The depression models were induced through using separate and chronic unpredictable mild stress for 28 days, and justified successfully by changes of parameters of open field test (OFT) and fluid consumption test (FCT) in rats. That depression induced occurrence of IBS was determined by observing clinic signs, and measuring the fecal particles as well as water content of feces in rats. Variations of ICa-L were recorded via whole-cell patch clamp technique in enzymatically dissociated single rat colonic myocytes both in control and depression group. Results: Compared with control group, depression models in rats were considered to be established successfully when body weights of rats increased slower, and all observed values of OFT and FCT were significantly lower (P<0.01, respectively). Based on the above, compared with control group, IBS had severe incidence rate in rats of depression group (P<0.01). And it was identified occurrence of IBS as abnormal colon motility when depressed rats showed severe clinic symptoms, and its fecal particles and water content of feces were obviously increased (P of all <0.01). Correlative analyses were shown that parameters values of fecal particles and water content of feces of depression rats were negatively correlated compared with observed values of OFT and FCT in depressed rats (r>-0.89, P of all <0.01). With voltage clamp mode, the current peak of ICa-L was significantly increased from (-21.31±4.79) pA in control colonic myocytes to (-33.52±4.45) pA in depress colonic smooth muscle cells under +10 mV clamp membrane (P<0.01). Moreover, the current-voltage (I-V) curve of ICa-L in depression colonic myocytes was diverted down to the bottom. Correlative analysis was confirmed that peak values of ICa-L of depressed colonic myocytes of rats were positively correlated compared with parameters values of fecal particles and water content of feces of depressed rats (r of all >0.91, P<0.01, respectively). Conclusion: The present data indicated that depression could induce the severe IBS symptoms in gastrointestinal tract of rats. The mechanisms might attribute to that depression could significantly increase the amplitude values of ICa-L, so that the depression might at least lead to the ion channel remodeling in colonic myocytes of depressed rats, which could contribute to abnormal action potential to facilitate occurrence of IBS in gastrointestinal tract of rats.
Key words: Key Words Depression    Colonic Myocytes    Ion Channel Remodeling    Irritable Bowel Syndrome    Action Potential Abnormality    

抑郁是引起肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)的重要致病因素,其在IBS的发病、症状发展与持续、治疗效果等方面起着不可忽视的作用和特征性联系[1]。它往往先于或伴随IBS出现,对其起到诱发或加重作用。抑郁与IBS相互作用,互为依存和放大,给抑郁患者带来极大精神病痛和胃肠道功能紊乱[2]。结肠平滑肌动力学异常和超敏反应是这一病理生理过程的具体表现,L-型钙通道(L-type calcium current,ICa-L)发生重构是它们的电生理基础和关键环节[3]。当抑郁发生后,结肠平滑肌细胞外Ca2+通过细胞膜上ICa-L进入细胞内,引起Ca2+内流增多,细胞膜电位升高,动作电位产生去极化状态,引起平滑肌细胞兴奋-收缩偶联增加,动作电位传导节律发生紊乱,导致结肠出现IBS病症[4],但有关抑郁引起结肠动力学改变导致细胞膜主要离子通道ICa-L重构引起IBS病症的电生理机制还不完全清楚,本文将对此进行探讨,为临床合理选择药物治疗抑郁合并IBS患者提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法 1.1 动物与溶液试剂

实验动物均选取SPF级Sprauge-Dawley(SD)雄性大鼠，由武汉大学医学院实验动物中心提供，鼠龄8周，体质量200-250 g。正常Tyrode液成分(mmol/L)：NaCl 147.0，KCl 5.4，CaCl2 2.0，glucose 10.0，MgCl2 1.05，NaH2-PO4 0.42，HEPES 10.0，pH用NaOH 调至7.35。无钙生理盐溶液(free-Ca2+ physiological saline solution,free-Ca2+ PSS)成分(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.0，MgCl2 1.2，葡萄糖 10.0，HEPES 10.0，pH用Tris-HCl调至7.4。获得结肠平滑肌细胞的消化液为含如下试剂的Ca2+-free PSS液：0.12% CollagenaseⅡ，0.2%胰蛋白酶抑制剂和0.2% BSA。记录ICa-L的电极内液成分(mmol/L)：CsCl 135.0，MgCl2 4.0，HEPES 10.0，Na2-ATP 2.0，EGTA 10.0，TEA 20.0，pH用CsOH调至7.3。记录ICa-L的电极外液成分为正常Tyrode液。HEPES、CollagenaseⅡ、胰蛋白酶抑制剂、BSA、CsCl、CsOH、Na2-ATP、EGTA、TEA 为Sigma公司产品，其它为国产分析纯。

1.2 实验分组与抑郁症模型制备及评估

本实验购回35只大鼠, 单笼饲养于本院实验动物中心(标准SPF级动物室)1周, 之后进行抑郁模型复制[5]。但在造模前, 先利用旷场试验(open field test, OFT)对每只动物展开水平和垂直运动筛查评分, 总得分低于30分和高于120分的动物予以剔除。被入选实验动物随机分为2组:正常对照组(对照组)与抑郁症模型组(抑郁组), 每组15只。对模型组动物采用慢性温和不可预知性应激刺激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)合并独笼孤养的经典方法制造抑郁大鼠模型。造模经过第28天后分别检测动物体重和摄食量, 采用OFT测定大鼠的行动, 观察液体消耗试验(fluid consumption test, FCT)中糖水消耗量作为快感缺乏的客观指标判定抑郁症模型是否复制成功。体质变化包括:大鼠体重增长数和摄食量; OFT包括:总行程、平均运动速度、穿越格数、后肢直立次数、理毛次数及粪便颗粒数; FCT包括:总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗, 大鼠的糖水偏爱(%)=糖水摄入/总液体消耗×100%。

1.3 抑郁对大鼠排便影响的观察指标

通过观察造模前后大鼠出现临床表现、生成的粪便性状和数量加以确定, 并最后确定抑郁诱发大鼠IBS发生率。临床表现主要观察动物体质、状态、活动度以及排便情况; 粪便性状和数量是计数大鼠粪便颗粒数和含水量, 具体方法是记录大鼠抑郁模型制造之前1 d和完成后第28天, 选取同一时间起始点记录2 h内大鼠排出粪便的颗粒数, 并进行收集、称重(湿重), 后用烘箱烘干(75 ℃, 2.5 h), 再称重(干重), 计算粪便含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。抑郁诱发大鼠IBS发生率(%)=抑郁数/观察组数×100%。

1.4 大鼠结肠平滑肌细胞的分离和全细胞膜片钳记录

大鼠经颈椎脱臼处死，剪开腹腔，在靠近回肠处取4-5 cm长的近端结肠，剖开、清洗、平摊并固定于硅胶板上。在解剖显微镜下分离黏膜层和黏膜下层得到肌条，将肌条剪成2 mm×4 mm小块，置于Ca2+-free PSS液中漂洗20 min，后在含消化液的Ca2+-free PSS液中消化15-20 min(37 ℃，100% O2饱和)，得到含有单个结肠平滑肌细胞悬液，置于4 ℃冰箱备用。吸数滴细胞悬液加入到倒置显微镜(IX 70-122，日本Olympus公司)载物台上的细胞记录槽中(25-30 ℃，260 μl,美国Warner公司)，静置5 min，后用100% O2饱和的记录ICa-L的细胞外液以2-3 ml/min速度冲灌10 min，用全细胞膜片钳记录方法对细胞进行钳制，脉冲信号由Pulse+Pulsefit软件(version8.31，德国HEKA公司)控制，经EPC-9放大器(德国HEKA公司)放大，Pulse软件收集并存储于计算机的硬盘中。玻璃微电极充灌电极内液后电阻为2.5-3.5 MΩ，对结肠平滑肌细胞进行封接，当封接电阻达1 GΩ以上后，补偿快电容，施加负压吸破细胞膜，给予慢电容和漏电容补偿，形成全细胞记录模式。

1.5 ICa-L记录及其电流-电压(I-V)曲线拟合

将膜电位钳制在-60 mV，指令电位由-60 mV到+50 mV，跃阶10 mV，钳制时间300 ms，可记录到一组缓慢的内向电流，此内向电流为ICa-L(单位：pA)，存入计算机以供统计分析。各组ICa-L的I-V曲线是以各自指令电位为横坐标，每个指令电位下的电流大小为纵坐标拟合而成。

1.6 统计学处理

计量数据符合正态分布和方差齐性以均数±标准差(x±s)表示，多组数据比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用F检验，统计分析用Origin 6.0软件完成；相关性分析用Pearson相关系数(r)法；计数资料以率表示。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 成功建立抑郁大鼠模型

与对照组比较，抑郁组大鼠明显消瘦，体重增长速度明显放缓(P＜0.01，n=15) ；穿越格数、前腿竖立次数、理毛时间均减少(P均＜0.01，n=15) ；糖水消耗、饮水总量、糖水消耗/纯水消耗均显著降低(P均＜0.01，n=15) 。提示本实验抑郁模型的制备取得成功(表 1) 。

表 1 建立抑郁大鼠模型的观察结果(x±s,n=15)
2.2 抑郁对大鼠排便影响

与对照组比较，抑郁组大鼠出现明显的毛发干枯、疏松、成直刺状，食欲减退、活动度减少、消瘦、排便次数明显增加，大便性状为稀水或糊状。排便颗粒数及其含水量分别由对照组的(3.95±0.48) 粒/2 h和(36.72±7.49) %增加为(7.31±1.03) 粒/2 h和(75.39±10.87) %(P均＜0.01,n=15) ；分别与抑郁组中OFT和FCT比较，排便颗粒数及其含水量呈显著的负相关性(r值均>-0.89,P均＜0.01)；与对照组比较，抑郁组大鼠出现上述症状的发病率达到87.36%，明显高于对照组的9.21%(P＜0.01,n=15) 。

2.3 抑郁对结肠平滑肌细胞ICa-L及其I-V曲线影响

研究发现，在对照组大鼠结肠平滑肌细胞膜上记录的内向电流，在-40 mV开始激活，+10 mV达到最大，后随钳制电压的增加，逐步减小，给予10 μmol/L尼卡地平，可严重抑制各钳制电压下的电流峰值，表明此内向电流为ICa-L(图 1A和B)。与对照组比较，抑郁组大鼠结肠平滑肌细胞膜上ICa-L自激活开始，在各钳制电压下均明显增加，当钳制电位为+10 mV时，其ICa-L由对照组的(-21.31±4.79) pA增加为(-33.52±4.45) pA(P＜0.01，n=15) (图 1C)。与抑郁组大鼠排便颗粒数及其含水量比较，抑郁组大鼠结肠平滑肌细胞膜上ICa-L与它们具有显著正相关(r均>0.91,P均＜0.01) 。从各组拟合ICa-L的I-V曲线上发现(图 1D)，对照组的I-V曲线处在中部，最大峰值在+10 mV左右；抑郁组I-V曲线处在最底部，最大峰值在0 mV左右，略向左偏移，但各组I-V曲线形态没有发生明显改变。

图 1 结肠平滑肌细胞膜上ICa-L及其I-V曲线变化 A.对照组；B.尼卡地平组；C.抑郁组；D.各组I-V曲线比较
3 讨论

抑郁患者比没有抑郁的病人更容易出现IBS症状,而IBS患者中几乎有一半患者会出现抑郁等精神心理障碍,但有关抑郁引起IBS病因基础目前仍处在初步研究阶段,对其影响IBS的详细机制还很少涉及,需要有更多实验投入到这些研究中[6]。本文对此开展了一些研究,首先是制备抑郁模型,结果发现抑郁组大鼠明显消瘦,体重增长严重放缓; OFT和FCT测试的各项观察指标明显低于对照组。提示这些大鼠的活动度严重不足,对周围的新鲜事情的好奇度严重缺乏; 失去对糖水的喜好,对新鲜事物表现出抵触情绪,对各种奖赏缺乏兴趣和热情度以及快感。说明本文抑郁组大鼠被成功复制成抑郁模型,且理论依据符合临床上抑郁患者起病于慢性、低水平的应激源促进疾病发生、发展的机理; 评价建立抑郁模型是否成功的标准和文献报道相一致,操作方法稍简单、易行,病死率不高,值得一些需要制造抑郁模型的实验室借鉴、尝试[7]。

本研究发现抑郁大鼠出现明显毛发干枯、食欲减退、消瘦、排便次数明显增加、大便表现为稀水或糊状,排便颗粒数及其含水量显著增高,与运动试验和液体消化试验各数据相比呈显著负相关。提示抑郁大鼠出现了严重的胃肠道症状,诱发了IBS,而且这种发生率达到87.36%。说明抑郁组大鼠在遭受长期慢性应激刺激后,精神上出现症状,之后诱发了胃肠道IBS病症[8]; 反映出抑郁导致大鼠结肠动力持续异常、运动过度以及节律失常,而IBS症状可能成为抑郁的躯体化表现,且这些顽固的躯体化症状反过来又加重抑郁症状反复发作和恶化[9]。

研究还发现抑郁大鼠结肠平滑肌细胞膜上ICa-L在各钳制电压下均显著增大,幅度增高,其I-V曲线明显上抬,并略向左偏移; 与其排出粪便颗粒数和含水量相比,具有显著正相关,提示抑郁诱发了大鼠结肠平滑肌细胞膜ICa-L的明显增加与开放速度增快,而这种ICa-L的增加和开放速度增快可能源自于抑郁大鼠结肠出现IBS病症[10]; 说明在抑郁长期刺激下,大鼠结肠平滑肌细胞膜ICa-L的数量出现了增加、或更多的开启与分布,抑郁造成了结肠平滑肌细胞膜ICa-L的电重构,在其基础上,细胞外Ca2+通过ICa-L进入细胞内增多,并引起Ca2+触发Ca2+释放的连锁反应,使肌浆网钙池中储备的Ca2+释放到胞质中,双管齐下,造成结肠平滑肌细胞内Ca2+超载,引起Ca2+震荡,诱发结肠性动作电位节律失常,动作电位上出现早后除极和(或)晚后除极,从而打破平滑肌正常的兴奋收缩偶联活动,使结肠平滑肌收缩反应过度,张力增高,最终诱发IBS症状[11]。所以本结果提示,抑郁大鼠结肠平滑肌细胞膜ICa-L的增加是抑郁引起患病大鼠出现IBS症状的动力基础和致病机制[12]。

总之,采用慢性不可预见性温和刺激加孤养相结合经典方法可成功制备抑郁动物模型。抑郁可促进大鼠结肠平滑肌运动异常亢进病理生理反应,致使动作电位的传导节律失常、紊乱,出现IBS病症,其电生理机制可能是抑郁引起了大鼠结肠平滑肌细胞膜ICa-L的异常增加引起离子通道电重构,导致结肠平滑肌细胞动作电位节律失常。通过本研究能针对性指导临床医师在治疗抑郁并发IBS症状过程中找到新的治疗靶点及其理论基础。

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