近年研究发现，肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts，CAFs)作为肿瘤微环境中的主要成分，通过分泌各种细胞因子和蛋白酶等参与了肿瘤细胞的生长、浸润和转移等多种生物学行为的调节^[1]。成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是新近发现的一种促肿瘤生长因子，它特异性表达于CAFs，通过发挥蛋白酶水解作用，促进肿瘤细胞生长和浸润，同时它也可以促进肿瘤内皮细胞增殖和新生血管的生成，加速肿瘤细胞的远处转移^{[2, 3]}。目前FAP在肿瘤发生中的具体作用机制尚不完全明了，而且FAP与胃癌生物学行为及预后的关系尚存在一定争议。因此，本文主要通过研究FAP在胃癌中的表达情况以探索FAP表达与胃癌生物学行为和预后的关系，为胃癌的临床诊治和预后判断提供理论依据。

选取2009年2月至2011年4月在我院就诊的胃癌患者作为研究对象，收集术后胃癌手术切除标本60例，并选取距肿瘤>5 cm的正常胃组织作为对照。其中男35例，女25例，年龄38-73(52.5±10.2)岁。根据2010年国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准进行临床分期，Ⅰ期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期27例，Ⅳ期8例。所有患者术前均未接受过任何放化疗或分子靶向治疗，所有标本经10%多聚甲醛固定，石蜡包埋后4 μm切片，常规行HE染色普通镜检。

常规脱水及石蜡包埋，连续切片厚度约4 μm做免疫组化染色。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)进行免疫组织化学染色。3%过氧化氢(H₂O₂)溶液在室温下作用10 min，然后在非免疫血清室温孵育10 min；试剂FAP兔抗人一抗(效价1:200，Santa Cruz公司)4 ℃孵育过夜；生物素标记的二抗孵育20 min；DAB显色5 min，PBS终止反应；苏木素复染、乙醇梯度脱水和二甲苯透明，中性树胶封固。

FAP表达于肿瘤间质CAFs的细胞质中，为棕黄色染色。每张切片在低倍视野下选取5个阳性细胞密集区，分别于400倍视野下计数100个CAFs细胞中的FAP阳性表达比例，计数标本的x±s。

常规组织连续切片4 μm厚、裱片、烘烤，HE染色与免疫组化染色。IHC具体步骤如下：室温下用3% H₂O₂孵育15 min，消除内源性过氧化物酶。每张切片用2% BSA 37 ℃封闭30 min，防止抗原与抗体非特异性结合。然后倾去BSA，滴加鼠抗人FAP一抗，37 ℃孵育2 h，然后用PBS冲洗3次，每次5 min，滴加相应二抗，37 ℃孵育15 min，最后用过氧化物酶标记的链霉素孵育15 min。再用PBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液显色，镜下观察显色反应，显色适度时终止反应。自来水充分冲洗，用苏木素复染，盐酸乙醇分化，封片。阴性对照组的一抗用PBS替代。

图像采集系统为Olympus BX51荧光显微镜，配备Olympus DP72照相机(Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan)。在显微镜明场下，分别于“×10”、“×20”、“×40”视野观察切片并拍照。

所有数据均用均数±标准差(x±s)表示, SPSS 16.0统计软件分析, 配对资料间的比较采用配对t检验。生存分析采用Kaplan-Meier分析, 组间比较采用Log-rank法。两组间比较用Mann-Whitney U test法，三组间比较采用Kruskall-Wallis test法。当P < 0.05时表示差异有统计学意义。

FAP在肿瘤间质成纤维细胞胞质内阳性表达，呈棕黄色或浅黄色。60例胃癌组织中FAP阳性表达率在91.7%(55例)。FAP在正常胃组织和肿瘤细胞中基本上无明显表达。60例胃癌组织与60例正常胃组织中FAP阳性细胞数平均值分别为32.80±19.3和0.41±0.21，差异具有统计学意义(P < 0.01)。

胃癌组织中FAP的表达水平与肿瘤的大小、分化程度及临床分期明显相关(P < 0.05)。肿瘤直径越大、分化程度越低、分期越晚的癌组织中FAP表达水平越高。癌组织中FAP表达水平与患者性别、年龄、吸烟状况无明显统计学差异(P > 0.05)(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 FAP的表达与胃癌患者临床病理特征的关系 临床病理参数 例数(%) FAP表达比例(%) P 性别 0.309  男 35(62.5) 34.82±12.55  女 25(37.5) 30.71±11.48 年龄(岁) 0.254   < 60 32(55.0) 38.85±10.12  ≥60 28(45.0) 35.67±13.21 吸烟 0.059  否 25(37.5) 25.95±21.78  是 35(62.5) 37.16±19.23 肿瘤直径(cm) 0.024   < 5 34(60.0) 42.78±20.42  ≥5 26(40.0) 28.21±15.21 分化程度 0.002  低分化 28(45.0) 45.44±13.01  中分化 17(30.0) 35.56±15.54  高分化 15(25.0) 16.29±8.63 TNM分期 0.001  Ⅰ-Ⅱ期 25(42.5) 24.52±6.38  Ⅲ-Ⅳ期 35(57.5) 57.06±20.13

表 1 FAP的表达与胃癌患者临床病理特征的关系

镜下观察显示胃癌组织内FAP染色结果为阳性，其表达主要位于胞质或胞膜。FAP在胃癌间质内少量表达，主要位于胃癌间质中靠近肿瘤血管内皮细胞处，该表达特征需要进一步研究，推测FAP与癌细胞黏附血管内皮具有相关性。FAP虽然在胃癌的表达具有普遍性，但不同分化程度的胃癌组织内FAP表达量无明显差异，提示FAP与胃癌恶性程度的关联意义不大(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 胃癌组织切片HE染色和FAP免疫组化染色 A1+B1(×100)：胃癌组织HE染色；A1+A2：中-高分化胃腺癌；B1+B2：中-低分化肠型腺癌；A2+B2(×200)：免疫组化染色结果示FAP主要表达于胃癌细胞的胞质和胞膜，FAP在间质内主要表达于靠近肿瘤血管内皮细胞处；红色箭头指示癌组织内FAP染色阳性部位，蓝色箭头指示间质内FAP的表达。

60例患者中有3例患者失访，所有患者按照FAP阳性细胞数平均值为(32.80±19.3)%，分为低表达组和高表达组。Kaplan-Meier分析显示FAP低表达组胃癌患者术后的生存时间明显高于高表达组，差异有显著统计学意义(P < 0.05)。FAP高表达组和低表达组的中位生存时间分别为30.2和37.8月(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 FAP的表达与胃癌患者预后的关系

胃癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。这是由于胃癌的早期诊断困难，大多数胃癌患者确诊时已经属中晚期，失去手术机会，放化疗疗效不佳。因此，寻找一种有效的早期诊断、指导治疗和预后的分子标志物具有极其重要的临床价值。近年研究发现，特异性表达与肿瘤相关成纤维细胞中的FAP在肿瘤的发生、浸润和转移等一系列过程中发挥重要作用^[2]。FAP是CAFs的特异性标志物之一，在肿瘤间质中呈高度特异性表达^[4]；在肿瘤的早期诊断、预后判定和治疗中的应用有重要价值，已成为近年研究热点。

FAP是在1986年由Retting等用单克隆抗体F19 (用肺成纤维细胞免疫小鼠获得)在培养的成纤维细胞上识别的一种细胞表面抗原，所以最初被称为F19抗原^[5]。FAP存在于多种恶性上皮性肿瘤的间质(如肺癌、乳腺癌、肠癌及胃癌等)和活化的成纤维细胞膜上，而在良性肿瘤间质及正常成人静息的成纤维细胞中不表达^[6]。这提示了FAP是一个增生的成纤维细胞标志物，与恶性肿瘤的生物学行为可能有关。FAP的生物学特性研究发现，FAP是一种丝氨酸肽酶，在细胞表面发挥着蛋白水解酶活性，它在降解细胞外基质组份中发挥着至关重要的作用，对肿瘤浸润、血管生成和转移起到很好的促进作用^[2]。其机制可能是FAP通过直接或间接溶解与毗邻的细胞外基质和参与肿瘤微血管生成^[1]，从而发挥上述作用。

近年来，在多种实体瘤间质中发现FAP的表达，FAP的表达水平与肿瘤的增生、侵袭和转移生物学行为明显相关。在肠癌手术标本及肠癌小鼠移植瘤模型中，发现90%以上的标本表达FAP，且其表达水平与肿瘤的浸润深度、大小、淋巴结转移明显相关，同时高表达FAP患者的总生存时间明显下降^[7]。同样，在胃癌患者肿瘤间质细胞中，FAP也呈高表达，另外还发现，FAP在恶性程度高的硬癌中的表达水平明显高于其他组织类型^[8]。Wang等发现FAP在胃癌间质中高表达，并且通过小干扰RNA敲除FAP表达基因，可以明显抑制肿瘤细胞的转移，这说明FAP的表达水平与胃癌的远处转移和淋巴结转移相关^{[8, 9]}。本研究与Wang的研究结果一致，发现FAP在胃癌间质中大量表达，另外本研究还发现，FAP的表达与肿瘤的分化、大小、远处转移和临床分期明显相关，且首次发现胃癌间质中FAP的表达水平与胃癌的预后呈负相关，这为以后胃癌预后判断提供重要理论依据。

总之，我们的研究表明FAP表达与胃癌的肿瘤大小、分化程度、TNM分期和预后明显相关。FAP所具有的酶活性使其在肿瘤中的生长、侵袭和转移中发挥着重要作用，并使它成为肿瘤诊断、预后判断和治疗的一个新的潜在靶点。