丙氨酸-乙醛酸转氨酶2类似物1(alanine-glyoxylate aminotransferase 2-like 1，AGXT2L1)又名ETNPPL，其基因位于人类染色体的4q25，因与丙氨酸-乙醛酸转氨酶2(alanine-glyoxylate aminotransferase 2，AGXT2)序列存在36%的一致性而得名。对该基因进行的研究目前较少，有限的文献提示这个基因的异常表达与多种精神疾病的发病有关^[1-3]。例如在精神分裂和双相情感障碍患者脑中，AGXT2L1的表达明显增高^[1]；在躁狂小鼠模型中，给予心境稳定剂碳酸锂后，动物大脑中AGXT2L1的表达显著增加^[2]。但是AGXT2L1的更详尽的功能仍未阐明，尤其在肿瘤研究领域，AGXT2L1扮演的角色还不清楚。

在本研究中，我们以肝细胞癌细胞系为研究对象，检测AGXT2L1的表达情况，并通过siRNA干扰技术，检测靶向敲低AGXT2L1对肝细胞癌细胞转移相关表型(细胞运动能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力)的影响。

本实验采用的细胞系均由我实验室冻存细胞复苏而得，以含有10%胎牛血清及1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养液培养，培养环境为37 ℃、饱和湿度、5%CO₂体积分数。肝细胞癌细胞系呈贴壁生长，定时更换培养液，细胞铺满培养瓶底时以0.25%胰蛋白酶消化传代，继续培养。

设计、合成靶向AGXT2L1的siRNA (由江苏吉玛合成，见表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 AGXT2L1-siRNA引物序列 序列名称 正义序列(5′-3′) 反义序列(5′-3′) AGXT2L1-siRNA-1 GCAGCUCUGGGAUGGAAUATT UAUUCCAUCCCAGAGCUGCTT AGXT2L1-siRNA-2 CCGGAGAAACUCUCUGUUUTT CCGGAGAAACUCUCUGUUUTT AGXT2L1-siRNA-3 GCCCAUAUAAGUUUCAGAATT UUCUGAAACUUAUAUGGGCTT 阴性对照 UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT

表 1 AGXT2L1-siRNA引物序列

将各组细胞接种于6孔板中，当细胞融合达到60%-70%左右时进行转染，具体转染步骤参见LipofectAMINE^TM2000试剂盒中提供的产品说明书。加入转染6 h后更换培养基，继续培养24 h后抽提RNA进行敲低效果验证和后续实验。

收集转染48 h后的各组细胞，采用实时定量PCR的方法检测AGXT2L1的mRNA表达情况。AGXT2L1的引物序列:上游引物5′-GCCGATGGACCTCATAGAAA-3′，下游引物5′-TGGGCTTCTTTCAGCATCTT-3′；内参β-actin的引物序列:上游引物5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′，下游引物5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。根据试剂盒说明书，将抽提的RNA反转录为cDNA, 并以此为模板进行PCR扩增。PCR反应条件:第一步，95 ℃ 10 min；第二步，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s, 共45个循环。以2^-ΔΔCT值表示目的基因mRNA的相对表达水平。

将97H细胞和HCCLM3细胞各分为两组，即对照组和AGXT2L1干扰组，分别转染对照siRNA和AGXT2L1-siRNA 12 h后，将细胞消化后重悬，种植于6孔板，置于二氧化碳培养箱培养。待细胞铺满板底，在孔板中央用1 ml枪头垂直划痕，PBS清洗两次后，继续培养72 h，然后在倒置显微镜下观察划痕处细胞的愈合情况。

在迁移实验中，将97H细胞和HCCLM3细胞各分为两组，即对照组和AGXT2L1干扰组，分别转染对照siRNA和AGXT2L1-siRNA 48 h后，用不含血清的DMEM培养液调整至1 × 10⁵个/ml, 接种150 μl于Transwell小室，下室24孔板内加入500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于二氧化碳培养箱24 h后，取出Transwell小室，用脱脂棉签擦去未穿过小室膜的上层细胞，随后用95%的乙醇溶液固定细胞，再用结晶紫染色15 min后，在倒置光学显微镜下随机取6个视野计数细胞数。在侵袭实验中，实验同样分为两组，细胞处理如上。将Matrigel基质胶稀释液50 μl涂在小室内膜，之后风干24 h。其余步骤同迁移实验。

作图及统计学处理软件使用GraphPad Prism 6, 定量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

我们首先使用实时定量PCR检测了AGXT2L1在不同肝细胞癌细胞系中的表达情况。结果显示，与正常肝脏细胞系L02比较，AGXT2L1在除原发性肝癌(PLC)细胞以外的7种肝细胞癌细胞系中均有不同程度的表达，其中97H细胞和HCCLM3细胞的表达量相对较高(图 1)，故我们选择这两种细胞作为后续的研究对象。

图 1(Figure 1)

图 1 在不同肝细胞癌细胞系中AGXT2L1的表达

siRNA转染细胞后，培养48 h，提取总RNA，实时定量PCR的结果显示:在97H和HCCLM3细胞中，与空白对照组和阴性对照组相比。三对siRNA对AGXT2L1的mRNA水平均有不同程度的抑制；且在两种细胞系中，AGXT2L1-siRNA-2的干扰效果均为最好(图 2)。siRNA-2的干扰效率接近75%，能满足后续实验的需要。

图 2(Figure 2)

图 2 使用RT-PCR验证AGXT2L1靶向siRNA的干扰功能 A.97H细胞；B.HCCLM3细胞

为了研究AGXT2L1对细胞二维运动能力的影响，我们进行了单层贴壁细胞的划痕愈合实验，观察转染对照siRNA和AGXT2L1-siRNA-2后，97H和HCCLM3细胞在划痕后24 h的愈合能力的差异。如图 3，与对照组相比，AGXT2L1干扰组的细胞划痕愈合能力明显减弱。

图 3(Figure 3)

图 3 AGXT2L1的干扰对肝细胞癌细胞迁移能力的影响 A:97H细胞；B:HCCLM3细胞

Transwell小室法检测结果显示，在97H和HCCLM3细胞中，与空白对照组相比，AGXT2L1干扰组的细胞三维迁移能力均显著下降(图 4):在97H细胞中，空白对照组迁移细胞数目为(104.0±12.7)个，AGXT2L1干扰组的迁移细胞数目为(70.8±8.9)个(P＜0.001)；在HCCLM3细胞中，空白对照组迁移细胞数目为(114.8±15.9)个，AGXT2L1干扰组的迁移细胞数目为(78.3±9.0)个(P＜0.001)。

图 4(Figure 4)

图 4 AGXT2L1的干扰对肝细胞癌细胞迁移能力的影响 A，B:97H细胞；C，D:HCCLM3细胞；与对照siRNA相比，***P＜0.001

基质胶Transwell小室法检测结果显示，在97H和HCCLM3细胞中，与空白对照组相比，AGXT2L1干扰组的细胞侵袭能力均显著下降(图 5):在97H细胞中，空白对照组的侵袭细胞数目为(65.3±9.8)个，AGXT2L1干扰组侵袭数目为(33.0±7.1)个(P＜0.001)；在HCC LM3细胞中，空白对照组侵袭细胞数目为(65.3±7.5)个，AGXT2L1干扰组的侵袭细胞数目为(41.5±3.4)个(P＜0.001)。

图 5(Figure 5)

图 5 AGXT2L1的干扰对肝细胞癌细胞侵袭能力的影响 A，B:97H细胞；C，D:HCCLM3细胞；与对照siRNA相比，***P＜0.001

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、进展迅速、预后差。美国癌症协会的最新数据显示，由肝癌导致的死亡病例在男女患者中分列第5位和第9位^[4]。我国是原发性肝癌的高发重灾区，而肝细胞癌又是肝癌中最常见的病理类型。所以，阐明肝癌发生及发展的机制，寻找与肝癌进展相关的关键基因具有重要意义。

磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PEA)是磷脂酰胆碱(卵磷脂，phosphatidylcholine)和磷脂酰乙醇胺(脑磷脂，phosphatidylethanolamine)的重要合成原料^[5]。作为细胞膜中含量最高的两种磷脂，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的异常可以导致细胞信号通路的传导异常，其可能机制是直接影响膜受体的活性，导致第二信使的产生出现异常^[6]。近些年来，有多项研究发现人工合成的外源性PEA对多种肿瘤细胞具有抑制作用^[7-11]。如在肾细胞癌中，PEA能抑制肿瘤细胞的肺转移，并且能够下调一系列肿瘤相关蛋白如细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、血管内皮生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)等^[7]；在黑素瘤细胞中，PEA会导致G₂/M的细胞周期阻滞，并使线粒体膜电位发生异常、激活caspase-3依赖的细胞凋亡^[8]；在埃利希腹水癌和黑素瘤的动物模型中，PEA的治疗会抑制肿瘤的增殖，延长动物的生存时间，而且并不会造成肝毒性和骨髓抑制^[9]。

有趣的是，最近有研究发现AGXT2L1的表达产物具有PEA的磷酸酶活性，会不可逆地将磷酸乙醇胺降解生成乙醛、磷酸盐和氨，因而又得名乙醇胺磷酸基水解酶(ethanolamine-phosphate phospho-lyase，ETNPPL)^{[12, 13]}。故AGXT2L1很可能是调控细胞磷脂合成的关键基因。根据已有的文献我们推测，如果在肿瘤细胞内靶向敲低AGXT2L1, 会造成肿瘤细胞内源性PEA的贮积，起到与外源性PEA类似的抑制肿瘤的作用。

在本研究中，我们发现AGXT2L1在多种肝细胞癌细胞系中均有表达，且在97H和HCCLM3这两种细胞系中表达尤为明显。这两种细胞系是恶性程度高、转移潜能强的细胞系，故我们推测AGXT2L1可能对于肝细胞癌的转移具有重要调控作用。所以我们使用RNA干扰技术在肝细胞癌细胞系中敲低AGXT2L1后，检测了肝细胞癌细胞的二维运动、三维迁移和侵袭能力，结果显示细胞的转移相关表型均被明显抑制。我们的数据提示AGXT2L1的异常与肝细胞癌的转移扩散有密切联系。

本研究首次利用细胞实验证实了AGXT2L1在肿瘤转移中的功能，并为PEA可以抑制肿瘤的进展提供了新的证据。然后AGXT2L1调控肿瘤转移扩散是否还有其他机制，AGXT2L1在其他肿瘤中的功能又是怎样的，仍有待于进一步研究。