复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指连续两次或三次及以上的自然流产^[1]，发病率约1%-5%^[2], 严重危害妊娠妇女的身心健康。其病因复杂，除了染色体异常、甲亢、糖尿病等内分泌疾病，感染及生殖道畸形等明确因素外，仍有70%以上的患者病因不明，我们称之为不明原因复发性流产(unexpained RSA, URSA)。近年来研究发现URSA主要与母胎界面局部免疫失衡有关^[3]。从免疫学角度而言，妊娠产物对母体而言是半异己的同种移植物，母体免疫系统能否识别并耐受胚胎及其抗原，直接影响妊娠的建立与维持。一旦母胎间免疫耐受遭到破坏，引起免疫细胞及其因子发生紊乱，可导致母体对胚胎发生免疫排斥反应，从而引起流产。本课题旨在研究不明原因复发性流产母胎界面蜕膜组织中子宫自然杀伤细胞免疫表型和T淋巴细胞亚群及其细胞因子的变化，探讨URSA可能的发生机制，为预防和治疗URSA提供实验室依据。

对象选择：①实验组：选取2009年11月至2014年1月在贵州省人民医院妇科不明原因复发性流产患者30例(URSA组)；②对照组：同期正常妊娠实施计划生育手术孕妇30例(正常早孕组)。两组孕妇均无内分泌疾病；血糖、甲状腺功能均正常；未经辅助生殖技术治疗；无免疫性疾病，未经免疫药物治疗；无生殖道解剖畸形及生殖道感染。其中URSA组患者B超提示宫内胚胎无心管搏动(稽留流产)，计划生育术后胚胎绒毛行染色体检查无异常。患者均为连续发生两次或三次及以上的自然流产，既往无内分泌、免疫、生殖道畸形或感染性疾病及早产、妊高症等不良孕产史。本次妊娠定义为URSA。正常早孕组患者B超提示宫内胚胎发育正常，自愿进行计划生育手术。既往无自然流产、早产、妊高症等不良孕产史，本次妊娠无先兆流产病史。两组研究对象在年龄及终止妊娠孕周数上差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。本研究已通过贵州省人民医院伦理委员会审核。两组患者均知情并签定知情同意书。

表 1(Table 1)

表 1 两组孕妇临床资料比较 组别 n 年龄(岁) 终止妊娠孕周 URSA组 30 28.75±4.58 8.19±1.24 正常早孕组 30 27.12±4.37 7.54±1.66 P - 0.164 0.091

表 1 两组孕妇临床资料比较

人淋巴细胞分离液(Ficoll)购自贵阳恒因生物试剂有限公司，荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体PerCP-CD3、FITC-CD4、FITC-CD16、FITC-CD56、APC-IL-4、PE-INF-γ及破膜剂，刺激剂均购自美国Becton-Dickinson公司，流式细胞仪为美国Becton-Dickinson公司产品。

URSA组孕妇于计划生育手术中(可视人流操作系统)取胚胎着床处子宫蜕膜组织2 g，同时胚胎绒毛行染色体检查无异常后纳入研究组。正常妊娠组孕妇于计划生育术中取胚胎着床处子宫蜕膜组织2 g。两组患者蜕膜组织均剪碎至约1 mm²大小，经50 μm孔径的尼龙网过滤后，制备单个细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，PBS液洗涤离心并配置成细胞悬液，使细胞数量控制在1×10⁶/ml，8 h内送流式检验。

将荧光抗体PerCP-CD3、FITC-CD4、FITC-CD16、FITC-CD56加入细胞悬液避光染色15 min用流式细胞仪测定，计数CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、CD56⁺ CD16⁺ NK细胞百分比。将PerCP-CD3、FITC-CD4染色的试管终止反应洗涤离心，去除未结合的抗体，加破膜剂及刺激剂后经4-6 h孵育后加入细胞因子抗体APC-IL-4、PE-INF-γ避光20 min，PBS洗涤离心并重悬。用流式细胞仪测定，计数分泌INF-γ的Th1细胞及分泌IL-4的Th2细胞比例。

采用SPSS 16.0统计软件对所得数据进行独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果以均数±标准差(x±s)表示。

由表 2可见，URSA组CD4⁺T细胞百分比高于正常妊娠组(P＜0.05)，CD8⁺百分比低于正常早孕组(P＜0.05)；URSA组CDl6⁺CD56⁺ NK细胞百分比高于正常早孕组(P＜0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 两组孕妇蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞和CDl6+CD56+NK细胞百分比的比较 组别 n CD4+ (%) CD8+ (%) CDl6+CD56+ (%) URSA组 30 46.02±8.45 34.96±6.69 24.92±8.63 正常早孕组 30 38.78±7.84 44.02±7.01 17.89±6.24 P - 0.001 0.017 0.012

表 2 两组孕妇蜕膜CD4+T细胞、CD8+T细胞和CDl6+CD56+NK细胞百分比的比较

由表 3可见URSA组Th1细胞、Th1/Th2比率明显高于正常早孕组(P＜0.01)。

表 3(Table 3)

表 3 两组孕妇蜕膜Th1、Th2细胞百分比及Th1/Th2比较 组别 n Th1(%) Th2(%) Th1/Th2 URSA组 30 22.81±4.07 2.17±1.19 10.73±4.66 正常早孕组 30 13.14±2.40 3.56±1.33 3.68±1.97 P - 0.001 0.003 ＜0.001

表 3 两组孕妇蜕膜Th1、Th2细胞百分比及Th1/Th2比较

母胎界面(Maternal-Fetal Interface)是母体组织与胎儿成份直接接触的界面，由来自胚胎的滋养层和来自母体的底蜕膜构成。胚胎对母体而言类似于同种异体移植物。母儿免疫耐受与滋养层上抗原被封闭并产生免受母体攻击的免疫抑制因子相关。同时蜕膜细胞产生的蜕膜抑制因子对胚胎的成功种植也起到保护作用。因此，决定妊娠成功与否的免疫学机制主要取决于母胎界面免疫学微环境的稳定性。目前URSA发生机制还不十分清楚，但很多研究已经证实URSA与母胎界面局部免疫功能紊乱相关^[4]。一旦母胎界面免疫微环境遭到破坏，免疫系统启动对胎儿的免疫攻击，就会导致流产的发生。

正常妊娠过程中，母体通过自身的免疫调节有效制约母体对胚胎产生的排斥反应^[5]。T细胞是执行特异性细胞免疫应答的重要细胞。主要分为CD4⁺和CD8⁺两大亚群。研究表明CD8⁺ T细胞在正常早孕妇女外周血中增加，说明其有利于妊娠的进展。CD8⁺ T在早孕期间分泌的细胞因子有利于胚胎的种植及胎盘的正常发育，同时可以抑制B淋巴细胞介导的体液免疫，并对CD4⁺ T细胞有负性调节作用，抑制CD4⁺ T细胞介导的T淋巴细胞增殖反应^[6]。与之相反，CD4⁺ T细胞可产生细胞因子IL-2，促进T淋巴细胞增殖反应后免疫应答的发生。二者之间相互竞争、相互制约、相互平衡。CD4⁺ T细胞还可以抑制体内产生对维持妊娠有利的封闭抗体，从而引起RSA。本研究结果显示：与正常妊娠组相比，URSA组CD4⁺T细胞增加，CD8⁺T细胞减少，CD4⁺/CD8⁺升高。表明母体细胞免疫活性增强，免疫平衡状态受到破坏，趋向于免疫排斥而导致URSA。

底蜕膜局部的淋巴细胞中除T淋巴细胞外，子宫自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)占绝大多数^[7]。母胎界面蜕膜组织处的自然杀伤细胞是唯一具有免疫活化潜能的免疫活性细胞。正常情况下其处于免疫抑制状态，避免正常免疫杀伤。一旦免疫平衡遭到破坏，其自发产生细胞毒性活性，以非主要组织相容性复合体限制形式杀伤各种靶细胞，在母胎界面免疫中起重要作用。NK细胞表面特异性白细胞分化抗原CD56、CD16为其特异性标志。CD56⁺CD16⁺NK细胞表面高表达CD16，介导NK细胞的抗体依赖性细胞毒作用，具有免疫排斥杀伤作用和细胞毒作用。其不直接作用于细胞本身，而是产生TNF-γ，从而活化巨噬细胞，引起局部细胞因子NO、TNF-α、IL-2升高，损伤并杀死胚胎。CD56⁺CD16^-NK细胞不表达或低表达CD16，对同种异体抗原具有营养及免疫调节作用。其活化后产生多种有利细胞因子，对维持胚胎的正常生长发育起着重要的保护作用。若母胎界面蜕膜组织中CD56⁺CD16⁺NK细胞含量增高而CD56⁺CD16^-NK细胞含量下降将导致妊娠失败。多项研究表明^{[8, 9]} URSA患者无论是外周血，黄体期内膜还是子宫蜕膜组织中CD56⁺CD16⁺均增高，与本研究实验结果一致。表明在URSA组患者体内确实存在着较高水平的CD56⁺CD16⁺ NK细胞所致的比率失衡，可能与RSA的发生有关。

细胞因子与正常妊娠的维持密不可分，母胎界面的细胞因子可能是维持同种异体耐受的核心。各种原因引起母胎界面免疫微环境失衡将使胚胎失去免疫保护发生排斥，从而发生RSA。CD4⁺T辅助性细胞(Th)根据分泌的细胞因子类型不同分为Th1和Th2细胞。Th1型细胞介导细胞免疫反应，促进巨噬细胞活化、产生细胞毒作用。Th2型细胞介导体液免疫反应，促进嗜酸细胞和肥大细胞分化，抑制免疫炎症，减少过度损伤，具有免疫营养作用。正常情况下，Th1与Th2动态平衡，两者通过负反馈调节相互影响，相互制约。在围种植期，低水平表达的Th1型细胞因子TNF-α，IFN-γ促进内膜血管构建与转型，有利于胚胎着床。但受孕后，Th1型细胞因子的增高将不利于妊娠的维持。母体对胎儿的识别及妊娠的维持主要是通过占优势的Th2型细胞因子来实现的^[10]。Th2细胞分泌的细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-6及IL-10等通过负反馈效应抑制Th1型细胞因子的产生。上调MHC-Ⅱ类分子，抑制NK细胞活化，抑制巨噬细胞产生炎症刺激因子，从而使胚胎免受免疫损伤并限制细胞性毒作用。Th1型细胞因子包括干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-2及IL-12等，可直接损害胎盘或激活NK及LAK细胞活性，促进炎症反应及滋养细胞毒性作用，阻碍滋养细胞生长和胚胎发育，诱发胎儿流产。本实验研究显示：URSA组Th1细胞、Th1/Th2比率明显高于正常妊娠组，说明Th1升高将导致URSA的发生^[11-13]。

总之，母胎界面的免疫平衡是维持正常妊娠的重要条件之一。本研究表明母胎界面免疫的失衡与URSA发生相关，随着生殖免疫学的迅速发展，URSA的发病机制将得到进一步阐明，免疫治疗未来终将成为URSA治疗的一大热点。