Hes-1基因(hairy and enhancer of split 1，Hes-1)是细胞核内的一种干细胞分化的负调控转录因子，是Notch信号转导通路的一个重要效应分子，受Notch信号正调节^[1]。Notch-Hes1信号转导通路不仅可以精确控制细胞分化，还可以控制细胞的增殖和器官发育，其异常表达还能够导致多种肿瘤的发生^[2]。Wei等^[3]通过细胞培养实验推测，Notch信号通路可能介导了核雌激素受体参与的促增殖作用。Kannan等^[4]研究发现，Hes-1基因的表达异常和大多数肿瘤有着高度的关联，例如：卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等。又有研究资料指出，子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等均为雌激素依赖性肿瘤^[5]。基于以上报道，雌激素和Hes-1基因在子宫内膜细胞的生长及凋亡等过程中可能发挥了重要作用，因此本文从雌激素的角度出发，研究高水平β-雌二醇(β-estradiol, β-E₂)和Hes-1基因之间的相关性。

RNA抽提试剂(Trizol)：美国Invitrogen公司产品；寡核苷酸引物(Oligo dT(15)Primer)：美国Promega公司产品；逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)：美国Promega公司产品；Taq酶(Taq DNA Polymerase)：上海Promega公司产品；琼脂糖(agarose)：西班牙进口试剂，南京生兴生物技术有限公司分装产品；RNA酶抑制剂(RNasin)：华美生物工程公司(SABC)产品；dNTPs：美国Promega公司产品；17β-雌二醇：美国Sigma公司产品；PCR扩增仪PTC-150型：美国MJ公司；台式高速离心机5415D型：德国Eppendorf AG公司；稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ-5型：北京市六一仪器厂；水平电泳槽DYCP-31D型：北京市六一仪器厂；酶标仪BIO-RAD 550：美国BIO-RAD公司。

将16只雌性KM小鼠随机分为两组：卵巢切除生理盐水干预组(OVX+NS)和卵巢切除β-雌二醇干预组(OVX+E₂)。OVX+NS组小鼠在1.5 %戊巴比妥钠麻醉下手术去除双侧卵巢完整保留子宫，将取出的卵巢组织放入10%多聚甲醛组织固定液中保存，用于做HE染色石蜡切片，术后7 d，在无菌条件下，隔天，腹腔注射一次等体积0.9%的生理盐水，共干预10 d；OVX+E₂组小鼠采用同样的方法切除双侧卵巢并保存，术后7 d，在无菌条件下，按照1 mg/kg的剂量，隔天腹腔注射一次17β-雌二醇，共干预10 d。干预完成后，对小鼠进行尾静脉取血，所有收集的血液标本室温放置2 h后，待血块凝缩，置于高速离心机内15 000 r/min×15 min，吸取上清液转移至薄壁管内放入-20 ℃冰箱保存，用于ELISA测量小鼠血清雌激素变化的情况。

末次给药24 h后，取出所有实验小鼠的子宫内膜组织，-20 ℃冰箱保存；采用Trizol一步法抽提内膜组织总RNA，然后在存放RNA的离心管中加入DEPC水20 μl(依RNA的沉淀量而定)，弹匀使RNA沉淀溶解，-70 ℃超低温冰箱中保存。

① 混合液B的配制：dNTP_S 1.5 μl(终浓度为0.5 mmol/L)、5×RT buffer 6 μl(终浓度为1×)、M-MLV200 U、RNAsin 25 U，加入ddH₂O使总体积到16 μl。②混合液A配制：RNA 2 μl(终浓度为1 μg/μl)、OligodT(15)Primer 3 μl(终浓度为0.01 μg/μl)，加入ddH₂O使总体积到14 μl，将其完全混匀并进行离心。③把离心管放在PTC-150型的热循环仪上面，70 ℃反应5 min，待反应终止后立即放在碎冰中，3 min后加入B液，充分混匀，然后离心，再重新放在热循环仪上面42 ℃反应1 h，95 ℃，5 min使反转录酶灭活。待反应停止以后把RT产物(cDNA)取出，-20 ℃冰箱保存。

内参GAPDH基因引物序列以及Hes-1基因的引物序列，经NCBI BLAST网站比对验证，引物序列、片段大小及退火温度见表 1。PCR体系：dNTPs 0.2 mmol/L、Taq酶2.5 U、模板cDNA 2 μl、MgCl₂ 1.5 mmol/L、10×buffer 5 μl，上游和下游引物各0.5 μmol/L，加入ddH₂O使总体积至50 μl。PCR循环条件：98 ℃预变性5 min，然后开始热循环扩增，94 ℃条件下变性30 s，退火时间45 s，74 ℃延伸1 min，共计35个循环，74 ℃延伸4 min。

表 1(Table 1)

表 1 RT-PCR实验中的引物序列 基因 引物序列 片段大小(bp) 退火温度(℃) Hes-1 上游 5′-TCTACACCAGCAACAGTGG-3′ 401 50 下游 5′-TCAAACATCTTTGGCATCAC-3′ GAPDH 上游 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3′ 572 56 下游 5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′

表 1 RT-PCR实验中的引物序列

造模过程中切除的卵巢组织标本经10%多聚甲醛固定、常规脱水、透明、浸蜡、包埋，石蜡连续切片，进行HE染色并在光学显微镜下观察其组织形态，结果可见正常卵泡、卵丘(图 1、图 2)，确定为卵巢组织。

图 1(Figure 1)

图 1 HE染色卵巢组织切片(HE×100)

图 2(Figure 2)

图 2 HE染色卵巢组织切片(HE×200)

造模后，检测两组小鼠血清雌激素水平，通过SPSS 16.0软件包的独立样本间t检验，两组标本雌激素水平 (x±s)分别为30.20±8.15和187.18±41.19，OVX+NS组明显低于OVX+E₂组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

PCR反应产物10 μl，电压100 V，开始1.5%琼脂糖凝胶电泳，约30 min-1 h，在生物电泳图像分析系统(复日科技FR-200A全自动紫外与可见分析装置)下观察结果，所有标本均扩增出目标条带(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果 M：100 bp Ladder DNA marker；泳道1、2、5、9、10：OVX+NS组标本；泳道3、4、6、7、8：OVX+E2组标本

采用凝胶分析软件Quantity One 4.62(Bio-Rad公司产品)，对RT-PCR产物进行半定量分析，测定OVX+NS组与OVX+E₂组标本Hes-1基因和GAPDH基因的光强度(Adj.Vol)值，通过SPSS 16.0软件包的独立样本间t检验，结果显示，两组标本Hes-1基因和GAPDH基因的光强度比值(x±s)分别为0.16±0.06和0.06±0.01，OVX+NS组Hes-1基因mRNA的表达明显高于OVX+E₂组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Hes-1基因位于小鼠16号染色体的第26位，含有4个外显子，该基因家族包含7个成员Hes1-7。Hes-1基因的表达受跨膜蛋白Notch的调控，该过程被称为Notch-Hes1信号转导通路，该通路对细胞的分化起到抑制作用，其表达水平的高低和细胞的分化密切相关^[6]。Notch由受体、配体及靶基因三部分组成，普遍地存在于哺乳动物细胞的表面，是一类高度保守的受体蛋白，介导细胞间信号的传递^[7]。Notch与相邻细胞表明的配体结合后而被激活，因此Hes-1基因的表达也可以调控细胞间的相互作用^[8]。Hes-1基因是通过基因的转录向下游传递Notch信号，使大部分尚未成熟的细胞保持在未分化的状态，进而调控细胞使其产生对分化诱导因子的反应^[9]。Dailey等^[10]在对小鼠的研究中发现，Notch信号被抑制的时候，可以减少小鼠卵泡的形成。有研究表明，β-雌二醇和Notch信号转导通路在对裸鼠乳腺癌血管生成中有相互促进的作用^[11]，而Notch信号转导通路与其它信号转导通路在乳腺癌中还存在交互作用，如：Wnt、Ras等^[12]，同时也有少数报道Wnt通路和子宫内膜癌有关^[13]。

雌激素只有通过与雌激素受体(estrogen receptor, ER)相结合，才能在体内发挥生物学作用，通常情况下，长期外源性高水平雌激素的替代疗法(HRT)，或者无孕激素的拮抗作用，可导致女性体内的雌激素水平失衡，进而引起子宫内膜组织细胞的异常增生甚至癌变，例如，子宫肌瘤和子宫内膜癌等^[14]，Girgert等^[15]曾经报道，乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌均和雌激素有关，但雌激素的作用机制至今仍不明确。基于以上认识，在调控子宫内膜细胞的分化、增殖及凋亡过程中，雌激素和Notch信号传导通路发挥了重要的作用，可能参与雌激素依赖性子宫内膜癌的发生、发展。因此我们判断，Hes-1基因在高水平雌激素刺激下的小鼠子宫内膜组织中也可能有异常表达。

目前国内外少有关于Hes-1基因在雌激素刺激下子宫内膜组织中表达变化的相关报道，为验证雌激素对小鼠子宫内膜组织中Hes-1基因mRNA的表达水平的影响，因此本课题通过持续高水平17β-E₂对成年雌性去卵巢小鼠进行干预，然后对成年雌性小鼠子宫内膜组织中Hes-1基因的表达水平与正常对照组进行比较，结果显示经过17β-E₂干预的成年雌性小鼠子宫内膜组织中Hes-1基因的表达水平显著低于OVX+NS组，证实了持续高水平17β-E₂刺激，可导致子宫内膜组织细胞中Hes-1基因的表达水平降低。故我们认为雌激素与Hes-1基因在雌性小鼠子宫内膜细胞组织中具有一定的相关性，ER-Notch信号通路，可能参与雌激素的刺激下子宫内膜细胞增生甚至癌变的机制，其可能作为一个新的研究子宫内膜癌基因治疗靶点。