武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (2): 182-188201   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.003.
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引用本文 

丁氏兰瑛, 曹晔萱, 赵旻, 方奇, 李凯勇, 徐战战, 周煜, 石芳, 万静. 缺氧状态下 miR-145 对兔平滑肌细胞生物学行为的影响[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(2): 182-188201. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.003.
DINH Thilananh, CAO Yexuan, ZHAO Min, FANG Qi, LI Kaiyong, XU Zhanzhan, ZHOU Yu, SHI Fang, WAN Jing. Effect of miR-145 on Biological Behavior of Rabbit Smooth Muscle Cells in Hypoxic Condition[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(2): 182-188201. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.02.003.

作者简介

丁氏兰瑛，女，1989-，医学硕士生，主要从事冠心病研究;
曹晔萱，女，1993-，医学硕士生，主要从事冠心病研究

基金项目

国家科学自然基金资助项目(编号：81670409)

通讯作者

万静，女，1972-，医学博士，教授，主要从事冠心病临床与基础研究

文章历史

收稿日期：2016-08-26
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
缺氧状态下 miR-145 对兔平滑肌细胞生物学行为的影响
丁氏兰瑛 1, 曹晔萱 1, 赵旻 2, 方奇 1, 李凯勇 1, 徐战战 2, 周煜 2, 石芳 2, 万静 1     
1. 武汉大学中南医院心血管内科 湖北 武汉 430071;
2. 武汉大学基础医学院病原生物学系 湖北 武汉 430071
收稿日期：2016-08-26
基金项目：国家科学自然基金资助项目(编号：81670409)
作者简介：丁氏兰瑛，女，1989-，医学硕士生，主要从事冠心病研究;
曹晔萱，女，1993-，医学硕士生，主要从事冠心病研究
通讯作者：万静，女，1972-，医学博士，教授，主要从事冠心病临床与基础研究
丁氏兰瑛和曹晔萱为本文共同第一作者
[摘要] 目的: 探讨缺氧条件下miR-145对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移及凋亡的影响及可能作用机制。 方法: 采用组织贴壁方法培养获得兔原代VSMC。用脂质体转染法将miR-145 mimics转入VSMC细胞。实验设置为常氧条件下(21%O2，5%CO2，74%N2)空白对照组、miR-NC组、miR-145 mimic组、miR-145 inhibitor组；缺氧条件下(3%O2，5%CO2，92%N2)空白对照组，miR-NC组,miR-145 mimic组，miR-145 inhibitor组。应用real time PCR检测miR-145在各组细胞表达水平。 采用EdU染色检测VSMC增殖能力，Transwell实验检测VSMC细胞迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡。采用targetScan，miRanda和PicTar靶基因预测软件和DAVID数据库对miR-145进行生物信息学分析，预测可能的靶基因。 结果: 在常氧与缺氧条件下，与miR-NC组相比，转染miR-145 mimic组增殖率和迁移率明显减少，细胞凋亡率增高(P<0.05)；转染miR-145 inhibitor组增殖率和迁移率明显增加，细胞凋亡率下降(P<0.05)。同时与常氧条件相比，缺氧组增殖率和迁移率明显增加以及细胞凋亡率下降(P<0.05)。生物信息学分析提示miR-145靶基因的通路信号富集主要为促分裂素原活化蛋白激酶1(MAPK1)，细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)，钙/钙调素依赖蛋白激酶2D(Ca2+/CAMK2D)信号通路等。 结论: 缺氧条件下，在VSMC细胞中miR-145低表达、miR-145 过表达可以有效的抑制VSMC细胞增殖、迁移及促进该细胞凋亡。
关键词： 缺氧    miR-145    血管平滑肌细胞    增殖    迁移    凋亡    
Effect of miR-145 on Biological Behavior of Rabbit Smooth Muscle Cells in Hypoxic Condition
DINH Thilananh1, CAO Yexuan1, ZHAO Min2, FANG Qi1, LI Kaiyong1, XU Zhanzhan2, ZHOU Yu2, SHI Fang2, WAN Jing1     
1. Dept. of Cardiovascular Medicine,Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071 ,China;
2. Dept. of Pathogeniology,School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071 ,China
[Abstract] Objective: To explore the effect of miR-145 on proliferation, migration and apoptosis of vascular smooth muscle cell (VSMC) under hypoxic conditions and its possible mechanism. Methods: Primary rabbit VSMCs were collected by tissue anchored method. MiR-145 mimics was transfected stably into cultured VSMC cells in vitro by using cationic liposome.Then, cells were divided into following groups: blank group, miR-NC group, miR-145 mimic group, and miR-145 inhibitor group under normoxic condition (21% O2, 5% CO2, 74% N2) and blank group, miR-NC group, miR-145 mimic group, and miR-145 inhibitor group under hypoxic condition (3% O2, 5% CO2, 92% N2). MiR-145 expression level in each group was detected by real-time quantitative PCR.VSMC proliferation, migration and apoptosis were evaluated by using EdU staining, transwell assay and flow cytometry, respectively.Bioinformatic analysis of miR-145 to predict the possible target genes was carried out by mean of targetScan, miRBase, MiRanda target gene prediction software and DAVID database. Results: Under normoxic and hypoxic conditions, in comparison with the miR-NC group, the proliferation and migration rate of the transfected miR-145 mimic group were significantly reduced, while apoptosis rate increased(P<0.05); at the same time, proliferation and migration rate of the transfected miR-145 inhibitor group were significantly increased and apoptosis rate decreased(P<0.05).Furthemore, compared with normoxic conditions, the rate of proliferation and migration of hypoxic group was significantly increased and apoptosis rate decreased (P<0.05).Bioinformatics analysis revealed that miR-145 target gene pathways were mainly mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), cyclin-dependent kinase 6 (CDK6), and calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2D(Ca2+/CAMK2D), etc. Conclusion: Under hypoxic conditions, miR-145 was low-expressed in VSMC cells, while overexpression of miR-145 could effectively inhibit the proliferation and migration of VSMC and promote the apoptosis.
Key words: Hypoxia    miR-145    Vascular Smooth Muscle Cell    Proliferation    Migration    Apoptosis    

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是血管中层的主要细胞[1]。VSMC向损伤的内膜迁移、浸润和增殖是冠心病、支架内再狭窄、冠状动脉旁路移植术后桥血管狭窄等增殖性血管疾病发生发展的主要病理基础 [2, 3]。而缺氧是以上疾病共有的局部微环境。氧参与机体内多种生理过程如能量代谢、细胞自噬、血管再生等 [4, 5]。因此缺氧在多种疾病尤其是心血管疾病的病理过程起了重要作用。miRNA是一类非编码单链RNA，长约18-24个核苷酸，能与靶mRNA完全或非完全匹配结合，引起靶mRNA降解或mRNA表达抑制，参与调控基因表达[6]。目前研究提示miR-145在正常动脉中表达最为丰富，在正常收缩状态VSMC中高表达，能够直接调节VSMC表型转换 [7, 8]。本研究通过模拟冠状动脉粥样硬化病变的局部缺氧微环境，在体外培养VSMC，比较常氧与缺氧环境对VSMC的生物学行为影响；同时改变miR-145在VSMC表达水平，观察miR-145对VSMC增殖、迁移及凋亡的影响，进一步探讨VSMC生物学行为潜在机制，为冠心病、支架内再狭窄、冠状动脉旁路移植术后桥血管狭窄等发生机制提供新的信息，为防治缺氧造成的心血管损伤提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

武汉大学动物实验中心提供的雄性新西兰白兔，体重约2.0 kg。DMEM高糖细胞培养基及胎牛血清均购于Gibco公司(美国)；miR-NC，miR-145 mimic，miR-145 inhibitor购于吉玛公司(中国)；胰蛋白酶购于杭州吉诺公司(中国)；EdU试剂盒购于广州锐博公司(中国)；荧光定量PCR试剂盒购于Bioneer公司(韩国)；α-actin 抗体、荧光Ⅱ抗抗体和抗荧光淬灭封片液均购于Proteintech公司(中国)；逆转录引物采用Primer 5.0在线软件设计，由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法 1.2.1 兔原代VSMC培养

采用组织块贴壁方法培养兔原代VSMC，传代并进行抗 αSM-actin 免疫荧光鉴定。VSMC纯度在90%以上为合格。3-10代内的VSMC进行下一步研究。

1.2.2 细胞培养，分组和转染

将VSMC置于21% O2,5% CO2,74% N2环境培养为常氧(Normoxia)组；VSMC置于3%O2，5%CO2，92%N2环境培养24 h为缺氧组；将常氧组及缺氧组(Hypoxia)分为4组：空白对照组是培养的VSMC不作任何处理；miR-NC组是细胞转染miRNA阴性对照模拟物，miR-145 mimic组是转染miR-145的模拟物，miR-145 inhibitor组是转染miR-145的抑制剂。将常氧环境的空白对照组设为常氧组；缺氧条件下的空白对照组设为缺氧组。各组细胞在含20%胎牛血清(FBS)加1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，按预设分组，将细胞分别置于常氧和缺氧环境，37 ℃培养箱中培养与传代。选用3-10代生长状态良好的VSMC。在转染前1 d向6孔板接种2×105个细胞，当细胞融合度达70%-80%时，按照Lipofectamine 2000说明书步骤对VSMC进行miR-145转染。

细胞缺氧培养：缺氧装置的主体包括上密封室，下密封室与进出气管道相连接，隔层架以及密封扣件。使用时，放入VSMC细胞培养皿，将3%O2，5%CO2，92%N2混合气体按15 L/min的流量充气约10 min。扣紧密封扣件防止漏气，将细胞置于37 ℃培养箱培养。

1.2.3 RT-PCR 检测miR-145表达

转染后24 h，按照预设分组，采用Trizol液法提取各组细胞的总RNA。NanoDrop 2000C微量分光光度计(美国Thermo公司)测定RNA的浓度和纯度。 利用茎环引物逆转录法，以U6 snRNA作为内参，制备miR-145的cDNA。逆转录反应条件：16 ℃，30 min；30 ℃ 30 s、42 ℃ 30 s、50 ℃ 1 s共60个循环；85 ℃，5 min。荧光定量PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 10 s、57 ℃ 1 min，45个循环。 采用的引物序列为：miR-145-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGC-ACTGGATACGACGGGATT；miR-145-上游引物：GGTCCAGTTTTCCCAGG；U6-RT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-CAAAAATATG；U6-上游引物： GCGCGTCGTGAAGCGTTC；通用下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。通过2-△△Ct法计算miR-145相对表达量，实验重复3次。

1.2.4 EdU法测细胞增殖

各组细胞转染24 h后，用胰酶消化，以4×103个细胞接种于96孔板，每组设3个复孔。在标准培养条件下培养过夜。按照EdU检测细胞增殖说明步骤进行EdU标记，固定细胞，Apollo染色和DNA 染色(Hoechst染色)等步骤后，将细胞置于倒置荧光显微镜观察。在波长505 nm激发光照射下，细胞核散发红色荧光的为增殖细胞，同一视野下，在波长400 nm激发光照射下，计数蓝色荧光的细胞核作为对照细胞。于是红色荧光细胞与蓝色荧光细胞比值表示细胞的增殖能力。随机选择5个视野进行拍照和计数，实验重复3次。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移

根据预设分组，收集各组细胞。取24孔板，每个实验孔加入600 μl含10%胎牛血清培养基。用无血清的培养基配置密度为8×104个/ml的细胞悬浮液200 μl接种到Transwell小室(聚碳酸酯微孔滤膜孔径8 μm)。将小室置于下室上方在标准培养条件进行培养24 h。第2天取出小室，用棉签小心擦拭滤膜上未迁移的细胞，采用4%多聚甲醛及结晶紫染液进行固定和染色。在倒置显微镜下观察。随机选择5个视野进行计数，取平均值作为穿过孔滤膜的细胞数量，实验重复3次。

1.2.6 细胞流式检测细胞凋亡

转染24 h后，采用不含EDTA的胰酶消化，各组细胞制成单细胞悬液，预冷PBS洗涤2次。按AnnexinV-FITC细胞凋亡检测说明书进行AV/PI双染后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.7 miR-145的生物信息学分析

应用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http:www.microrna.org/) 及PicTar(http://www.pictar.org)三种靶基因预测软件预测miR-145的靶基因，取三者预测数据的交集，再结合miRecords(http://c1.accurascience.com/miRecords)中已证实的靶基因形成miR-145靶基因集合，利用DAVID数据库(http://abcc.ncifcrf.gov/)对靶基因集合进行京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 信号转导通路富集分析。

2 结果 2.1 原代VSMC培养与鉴定

倒置显微镜下观察贴壁的VSMC呈梭形或多角形,有多个突起。胞质密度高,不透明，核居中央,呈卵圆形，有多个核仁。在生长比较致密时细胞可平行排列，部分区域可见典型“谷-峰”样生长。取常规传代细胞经特异性抗体即抗平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)的单克隆抗体与羊抗兔荧光二抗结合，细胞胞质染红光，呈阳性反应。DNA染色使细胞核呈蓝色染光。Merge图表示两者融合，融合率高于90%以上，结果见图 1。

图 1 原代VSMC培养与α-actin分析鉴定 A:白光(×200); B:荧光(α-actin,×200)
2.2 缺氧条件下VSMC中miR-145的表达分析

转染后24 h，miR-145在VSMC表达情况如下：在常氧组中，miR-145 mimic 表达明显上调，与miR-NC组相比上调32.93倍(P＜0.05); miR-145 inhibitor 与miR-NC组相比下调0.62倍(P＜0.05); 而空白对照组与miR-NC组相比无明显差异(P>0.05)；在缺氧组中，miR-145 mimic表达与miR-NC组相比上调43.02倍(P＜0.05); miR-145 inhibitor与miR-NC组相比下调0.45倍(P＜0.05); 而空白对照组与miR-NC组相比无明显差异(P>0.05)；与常氧组相比，缺氧组miR-145表达降低0.55倍。结果提示VSMC在3%O2缺氧环境培养可抑制miR-145表达，结果见图 2。

图 2 实时荧光定量PCR检测VSMC中miR-145的表达水平 A:常氧；B：缺氧；与miR-NC组比较，*P＜0.05
2.3 miR-145抑制VSMC增殖

采用EdU法,检测各组细胞增殖情况。实验结果分析方法如下：红色荧光图(Apollo染色)为增殖状态细胞核，蓝色荧光图(Hoechst染色)为全部细胞核，红色荧光与蓝色荧光数量比为VSMC增殖率。在常氧条件下，转染miR-145 mimic组增殖率明显低于miR-NC组(P＜0.05);miR-145 inhibitor组增殖率高于miR-NC组(P＜0.05)；而空白对照组与miR-NC组无明显差异(P>0.05)。同样在缺氧条件下，miR-145 mimic组增殖率也低于miR-NC组(P＜0.05); miR-145 inhibitor组增殖率高于miR-NC组(P＜0.05)以及空白对照组与miR-NC组无明显差异(P>0.05)。另一方面，常氧组与缺氧组相比，缺氧组比常氧组增殖率显著升高(P＜0.05)。实验结果表示miR-145在常氧以及缺氧条件均可促进VSMC增殖，并缺氧条件下细胞增殖更为明显，结果见图 3。

图 3 EdU实验分析缺氧和正常氧条件下miR-145对VSMC的增殖影响
2.4 MiR-145抑制VSMC迁移

采用Transwell 实验检测细胞迁移能力。各组细胞经固定、染色等处理后，在倒置显微镜下观察并计数迁过小室滤膜的细胞数。常氧条件下，转染miR-145 mimic组与miR-NC组相比，VSMC迁移率明显减低(P＜0.05);miR-145 inhibitor组与miR-NC组相比，VSMC迁移率明显增加(P＜0.05)；而空白对照组与miR-NC组无明显差异(P>0.05)。在缺氧条件下，miR-145 mimic组与miR-NC组，VSMC迁移率也明显减低(P＜0.05);miR-145 inhibitor组与miR-NC组相比，VSMC迁移率明显增加(P＜0.05)以及空白对照组与miR-NC组无明显差异(P>0.05)。另外，与常氧组相比，缺氧组细胞迁移明显增多(P＜0.05)。上述结果表明常氧环境与缺氧环境条件下，高表达miR-145均可以抑制VSMC迁移；低表达miR-145可促进细胞迁移。同时表明与常氧环境相比，缺氧时miR-145抑制细胞迁移作用更为显著，结果见图 4。

图 4 Transwell实验检测缺氧和正常氧条件下miR-145对VSMC 迁移能力的影响 (×200)
2.5 miR-145促进VSMC凋亡

各组细胞传染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。如图 5所示，常氧条件下miR-NC组，miR-145 mimic组及miR-145 inhibitor组凋亡率分别为3.9%，7.1%，2.8%。缺氧条件下miR-NC组，miR-145 mimic组及miR-145 inhibitor 组凋亡率分别为2.8%，4.8%，1.0%。结果表明常氧与缺氧环境miR-145都可以促进VSMC凋亡，同时低表达miR-145可抑制VSMC凋亡(P＜0.05)。

图 5 miR-145对VSMC凋亡的影响
2.6 miR-145潜在靶基因的预测及通路富集分析

用TargetScan、miRanda和PicTar 靶基因预测软件预测miR-145的靶基因，其中TargetScan预测靶基因2 519个，miRanda预测7 464个，PicTar预测258个靶基因。结合miRecords 数据库中已证实的19个靶基因形成靶基因集合，取预测数据的交集，获得266个靶基因。应用DAVID数据库对靶基因进行KEGG 信号转导通路富集分析，结果显示：miR-145靶基因的信号转导通路显著富集于促分裂素原活化蛋白激酶1(MAPK1)、Wnt、扩张性心肌病等信号通路等(P＜0.05,表 1)。

表 1 Hsa-miR-145靶基因的信号通路富集分析
3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病、经皮冠状动脉介入术(PCI)术后支架内再狭窄、冠脉搭桥术(CABG)术后桥血管狭窄是临床常见的血管增生性疾病，可导致心肌缺血、缺氧甚至坏死 。而VSMC的表型转化在动脉粥样硬化中发挥关键作用。VSMC表型转化主要表现为增殖加速，细胞向损伤的血管内膜迁移以及产生多种胞外间质成分，促进动脉粥样硬化的发生发展[2]。同时缺氧是冠状动脉粥样硬化性心脏病、PCI术后支架内再狭窄、CABG术后桥血管狭窄等增生性疾病共有的局部微环境。缺氧可促VSMC迁移至血管内膜并增殖和分化促进粥样斑块形成，参与斑块的发生发展[9]。缺氧与miRNA的表达有密切关系 ，有研究表明缺氧可以与缺氧诱导因子HIF-1α基因位点结合使miRNA的表达改变[11]。本实验模拟体内局部缺氧微环境，在体外培养VSMC。实验已证实在缺氧条件下，可促进VSMC的增殖、迁移能力及抑制该细胞凋亡率。

目前研究发现多种miRNA参与动脉粥样硬化的发生发展，认为VSMC的生物学行为与miRNA家族中的一些成员有密切关系。例如：miR-126可通过抑制血管黏附细胞因子-1(VCAM-1) 表达，阻断白细胞在内皮的附着使动脉粥样硬化减少[12]；动物实验发现：miR-1，miR-21和miR-24可以改善缺血-再灌注损伤后的心肌梗死[13]；miR-21反义寡核苷酸可减少VSMC增殖，促进其凋亡，其作用与PTEN增加和Bcl-2减少有关[14]等。MiR-145是正常血管中和VSMC表达最为丰富的一类miRNA 。研究已证实miR-145在肺癌、胃癌、结肠癌细胞、转移骨肉瘤细胞，食管鳞状细胞癌细胞等多种细胞呈低表达状态并对以上细胞均有抑制细胞分化、增殖、迁移等生物行为[15]。但miR-145在VSMC中的作用和功能目前仍不清楚。本研究主要是通过体外实验，将miR-145 mimic及miR-145 inhibitor转入VSMC获得miR-145含量增高和降低的VSMC并观察细胞增殖、迁移及凋亡变化。结果表明高表达miR-145可抑制VSMC的增殖和迁移以及促进该细胞的凋亡；低表达miR-145可促进VSMC增殖和迁移以及抑制该细胞的凋亡。同时可发现与常氧条件下相比，缺氧条件miR-145在VSMC表达明显降低。

同时，利用生物信息学的方法，采用miRNA靶基因预测软件，对miR-145的靶基因进行了初步分析，以期发现miR-145对VSMC生物学行为调控的可能机制。结果表明，miR-145靶基因的信号转导通路显著富集于MAPK、Wnt、扩张性心肌病等信号通路等。目前已知细胞内的MAPK信号通路，主要包括p38MAPK、ERKs(extracellular signal regulated kinases)等多条信号通路，是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路。该途径通过级联反应调控多种细胞因子、炎性因子和转录因子的产生，参与细胞内重要信号传导与调控。细胞内的Wnt通路参与β-catenin的调控，也参与胞内多基因的表达调控。因此，可以推测miR-145通过调节上述信号通路，参与到VSMC细胞的增殖、迁移和凋亡等生物行为，并在动脉粥样硬化病变过程中发挥重要作用。

综上所述，本研究结果提示缺氧可通过下调miR-145表达导致VSMC表型转化包括促进VSMC增殖、迁移以及抑制细胞凋亡，从而加重血管损伤后的再狭窄程度，促进冠心病、PCI术后支架内再狭窄、CABG术后桥血管狭窄的发生发展。其具体调节机制以及是否存在其他的途径参与调节该过程也需要进一步研究。

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