脑缺血可引起血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment, VCI)^[1]。炎性反应是认知功能障碍的病理生理机制之一^[2]。损害相关模式分子(damage associated molecular patterns, DAMPs)是在机体应激的情况下由损伤或者激活的细胞释放的一组重要的免疫炎性因子，可作为内源性危险信号调节无菌性炎性反应。S100蛋白超家族和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是DAMPs的其中成员，均可与糖基化终末产物受体(recepter for advanced glycation endproducts, RAGE)结合，结合后可激活信号转导级联，上调与炎性反应有关的细胞因子^{[3, 4]}。DAMPs/RAGE是否参与脑缺血引起的血管性认知功能障碍目前尚不清楚。本研究拟评价HMGB1、S100B和RAGE的表达与大鼠脑缺血后认知功能障碍发生的关系。

健康雄性SPF级SD大鼠48只，3-4月龄，体重250-300 g，由武汉大学动物中心提供。采用随机数字表法，将其分为2组(n=24)：假手术组(SH组)和脑缺血组(BI组)。

腹腔注射10%水合氯醛3.0 ml/kg麻醉下，仰卧固定大鼠，以保温板保温，颈正中切口，钝性分离颈总动脉(CCA)，避免损伤迷走神经和交感神经干，将4号线穿于双侧CCA; 同时枕部切口暴露第一颈椎翼小孔，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后BI组以4号线双重结扎CCA，造成明显的脑缺血，建立脑缺血模型; SH组仅穿线，不结扎，不电凝双侧椎动脉。大鼠手术期间保留自主呼吸，维持直肠温度36.5-37.5 ℃。

分别于术后1、3、5和7 d时，每组取6只大鼠，采用Y型迷宫(张家港生物医学器械厂)测定大鼠的认知功能。记录正确反应次数和全天总反应时间(指全天完成10次反应中包括正确反应次数和错误反应次数所需的时间)。

分别于上述时点认知功能测试结束后，取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉下，取双侧海马，制备组织匀浆，裂解后，提取蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿法电转至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入合适浓度的一抗(HMGB1兔多克隆抗体：1:1 000，Abcam公司，美国; S100B兔多克隆抗体1:500，Epitomics公司，美国; RAGE兔多克隆抗体1:500，Cell Signaling Technology公司，美国)，置于4 ℃冰箱过夜。经TBST漂洗3次后，把膜转移到装有相应的酶联二抗的小盒中(1:1 000, GeneTex，美国)，显色，曝光，显影，定影。以β-actin作为内参。采用Scion Image软件定量分析积分光密度值。以目的蛋白条带积分光密度值与β-actin条带积分光密度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

分别于上述时点认知功能测试结束后，处死3只大鼠，腹腔注射水合氯醛3.0 ml/kg麻醉下，用肝素化的0.1 mol/L PBS经心脏灌注，随后用4%的多聚甲醛进行灌注固定，取脑组织，制备冰冻切片。将切片放入细胞培养皿中，用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。加入0.3% Triton X-100溶液，室温摇床30 min，用0.0l mol/L PBS漂洗5 min。加入3% BSA fraction Ⅴ溶液，室温封闭1 h，吸干多余的液体，滴加用3% BSA fraction Ⅴ溶液稀释的兔抗HMGB1多克隆抗体(稀释度1:100)、兔抗S100B多克隆抗体(稀释度1:100)和羊抗RAGE重组蛋白(30 μg/ml)，4 ℃孵育过夜。用0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加入用驴血清稀释的偶联Alexa Fluor-555的驴抗兔荧光二抗(稀释度1:150)和偶联Alexa Fluor-488的驴抗山羊荧光二抗(稀释度1:150)，室温下孵育2 h。用0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。贴片，用封片剂封片，放入冰盒里，荧光共聚焦显微镜下观察HMGB1、S100B和RAGE共表达情况。HMGB1和S100蛋白呈红色，RAGE蛋白呈绿色，HMGB1/RAGE和S100B /RAGE共表达呈黄色。

采用Prism 5.0统计学软件进行分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

与SH组比较，BI组术后1、3、5和7 d时正确反应次数减少，全天总反应时间延长(P＜0.05)，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两组大鼠不同时点正确反应次数和全天总反应时间的比较(n=6，x±s) 组别 正确反应次数(次) 全天总反应时间(s) 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d SH组 9.0±1.1 9.1±1.2 9.3±1.1 9.2±1.2 131±21 132±21 132±23 131±27 BI组 6.0±1.3a 6.1±1.4a 6.6±1.5a 6.8±1.6a 265±40a 266±39a 261±44a 262±41a  与SH组比较，aP＜0.05

表 1 两组大鼠不同时点正确反应次数和全天总反应时间的比较(n=6，x±s)

与SH组比较，BI组术后1、3和5 d时海马HMGB1、S100B和RAGE的蛋白表达上调(P＜0.05)，见表 2-4。

表 2(Table 2)

表 2 两组大鼠不同时点海马HMGB1蛋白表达的比较(n=3，x±s) 组别 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d SH组 0.76±0.05 0.77±0.07 0.75±0.06 0.77±0.07 BI组 1.32±0.15a 1.48±0.21b 1.23±0.12a 0.77±0.08 与SH组比较，aP＜0.05

表 2 两组大鼠不同时点海马HMGB1蛋白表达的比较(n=3，x±s)

表 3(Table 3)

表 3 两组大鼠不同时点海马S100B蛋白表达的比较(n=3，x±s) 组别 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d SH组 0.164±0.041 0.171±0.054 0.153±0.031 0.153±0.011 BI组 0.322±0.064a 0.414±0.052a 0.331±0.042a 0.183±0.024 与SH组比较，aP＜0.05

表 3 两组大鼠不同时点海马S100B蛋白表达的比较(n=3，x±s)

表 4(Table 4)

表 4 两组大鼠不同时点海马RAGE蛋白表达的比较(n=3，x±s) 组别 术后1 d 术后3 d 术后5 d 术后7 d SH组 0.82±0.07 0.83±0.06 0.82±0.08 0.81±0.09 BI组 1.65±0.15a 1.88±0.16a 1.73±0.13a 0.90±0.11 与SH组比较，aP＜0.05

表 4 两组大鼠不同时点海马RAGE蛋白表达的比较(n=3，x±s)

免疫荧光实验结果显示：HMGB1、S100B和RAGE主要在海马CA1区锥体细胞层的星形胶质细胞存在表达。认知功能障碍引起HMGB1、S100B和RAGE在星形胶质细胞表达上调。

Y迷宫实验是一种经典的评价与空间学习记忆功能直接相关的实验，可同时观察动物逃避条件反射能力和空间辨别能力。本研究参照文献[5]，采用结扎双侧颈总动脉的方法制备大鼠脑缺血模型，结果表明，与SH组比较，BI组术后1、3、5和7 d时正确反应次数减少，全天总反应时间延长，提示大鼠发生了脑缺血后认知功能障碍。

HMGB1是一种晚期炎性介质，正常情况下存在于细胞核中。脑损伤时，HMGB1被激活，并从细胞内释放出来，诱导转录因子NF-κB的激活，参与炎性反应，从而诱导神经元凋亡^[6]。S100B是S100蛋白家族成员之一，主要表达于神经胶质细胞。脑损伤时，小胶质细胞被激活，S100B表达上调，诱导促炎介质的产生，进而诱发神经元凋亡^[7]。有研究表明，S100B的存在与认知功能呈负相关^[8]。

在细胞迁移和炎性反应时，HMGB1和S100B是RAGE的生理性配体。脑损伤时，HMGB1和S100B的水平与神经元的凋亡和变性相关^[9]。HMGB1/RAGE和S100B/RAGE均可通过激活激活核因子κB (NF-κB)，促进炎性反应，诱发神经元凋亡。研究表明，RAGE可通过多种途径，如增加Aβ通过血脑屏障、神经炎症、Aβ诱导的氧化应激和tau蛋白磷酸化等，引起神经退行性变，参与阿尔茨海默病(AD)的发生^[10]。而一项临床试验也表明，RAGE抑制剂可能减缓AD认知功能的下降^[11]。

本研究结果显示，与SH组比较，BI组术后1、3和5 d时海马HMGB1、S100B和RAGE的蛋白表达上调，同时伴随认知功能的下降，提示大鼠脑缺血后认知功能障碍发生机制可能与海马CA1区的HMGB1、S100B和RAGE表达上调有关。S100B通过与RAGE结合激活小胶质细胞，同时上调RAGE的表达，参与神经炎性反应，引起认知功能障碍。HMGB1诱导RAGE的表达，RAGE表达上调同时也能增强HMGB1的作用，进一步引起神经炎性反应，导致认知功能障碍。

综上所述，大鼠脑缺血后认知功能障碍发生机制可能与海马CA1区的HMGB1、S100B和RAGE表达上调有关。